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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 救命！载体构建！
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 救命！载体构建！

大家好啊！小弟在这里请教大家一个问题。
    我在做载体构建，将一个1700bp的片段连接到pCAMBIA1301上，首先PCR得到1700bp的插入片段，在该片段的两端分别有Kpn I与BamH I酶切位点。片段与载体用这两种酶双酶切后，用T4 DNA连接酶（TAKARA）连接。可是一直都没有链接成功。我开始时是同时双酶切的，后来改成分步酶切。但同样没有连接上。
    后来我PCR后直接将PCR产物与pMD18-T 载体连接，同样连接效率很差。挑取了15个担菌落只有1个是连接上的，但连接方向是反向的。我用Kpn I 与BamH I 分步酶切后于pCAMBIA1301连接，转化后没有长出菌来。
    我做了很长时间了，各种方法都试啦，都不成功。小弟都没有继续做下去的勇气啦。还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2009-08-06 15:16:01
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guotieying

银虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-6 15:32
末端磷酸化再试下
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本来无一物，何处惹尘埃。
2楼2009-08-06 15:31:36
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695

木虫 (职业作家)
我也是刚开始接触这块，帮楼主响应
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3楼2009-08-06 15:37:55
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xinlai

银虫 (小有名气)
感受态细胞有没有阳性对照？
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4楼2009-08-06 15:38:57
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银杏下

金虫 (小有名气)
★ ★
Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢！我的目的片段没有这两个酶切位点！ 8-6 15:43
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-6 19:44
你这种情况最有可能的是载体酶切效果不好，这个载体上KpnI和BamHI酶切位点太近，一个酶切完成以后另一个酶切位点基本上没有保护性碱基，另外可以再坚持下你的目的片段里有没这两个酶切位点，若是没有要不可以尝试载体酶切后去磷酸化，或换酶切位点。
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5楼2009-08-06 15:40:52
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
感受态细胞是没有问题的，做其他的转化都很好！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
6楼2009-08-06 15:44:22
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wjw992008

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
Anson1358(金币+1,VIP+0):片段短了连接效率高，很长就很难连了！ 8-6 18:20
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-6 19:44
这个~~
酶切回收后的载体及片断的质量是相当重要的，光键纯度要高一些。
连接之前测一测浓度及纯度，
如果质量还可以按照载体片断1：10进行连接，
双酶切连接效率还是挺高的，转化后可以达到80%阳性率。
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7楼2009-08-06 16:38:14
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beisimai895

木虫 (小有名气)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):难度很大啊！哎！！！！！！！！！！ 8-6 18:22
做连接，关键是体系，即目的片段与载体的量要加对，而且粘连的话，应该没什么难度的，祝好运。
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8楼2009-08-06 17:22:29
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我的片段已经在一个原核表达载体上了！序列也已经知道了！我用PCR扩增后连接到其他载体上！还用测序吗？大家指点一下
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9楼2009-08-06 19:41:44
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银杏下

金虫 (小有名气)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):我是说PCR扩增后连接到克隆载体后要不要测序！ 8-7 08:31
正常情况下可以不测序，因为DNA体内扩增突变率还是很低的。
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10楼2009-08-06 20:31:53
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