应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 救命！载体构建！
161/2返回列表12下一页
查看: 1108  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

[交流] 救命！载体构建！

大家好啊！小弟在这里请教大家一个问题。
    我在做载体构建，将一个1700bp的片段连接到pCAMBIA1301上，首先PCR得到1700bp的插入片段，在该片段的两端分别有Kpn I与BamH I酶切位点。片段与载体用这两种酶双酶切后，用T4 DNA连接酶（TAKARA）连接。可是一直都没有链接成功。我开始时是同时双酶切的，后来改成分步酶切。但同样没有连接上。
    后来我PCR后直接将PCR产物与pMD18-T 载体连接，同样连接效率很差。挑取了15个担菌落只有1个是连接上的，但连接方向是反向的。我用Kpn I 与BamH I 分步酶切后于pCAMBIA1301连接，转化后没有长出菌来。
    我做了很长时间了，各种方法都试啦，都不成功。小弟都没有继续做下去的勇气啦。还望哪位仁兄给指点一下。不胜感激！
回复此楼

» 猜你喜欢
一个人可以不成功，但不可以不成长！
1楼 2009-08-06 15:16:01
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

guotieying

银虫 (正式写手)
★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-6 15:32
末端磷酸化再试下
赞一下(6人) 回复此楼
本来无一物，何处惹尘埃。
2楼2009-08-06 15:31:36
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

695

木虫 (职业作家)
我也是刚开始接触这块，帮楼主响应
赞一下 回复此楼
3楼2009-08-06 15:37:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

xinlai

银虫 (小有名气)
感受态细胞有没有阳性对照？
赞一下 回复此楼
4楼2009-08-06 15:38:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

银杏下

金虫 (小有名气)
★ ★
Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢！我的目的片段没有这两个酶切位点！ 8-6 15:43
amisking(金币+1,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-6 19:44
你这种情况最有可能的是载体酶切效果不好，这个载体上KpnI和BamHI酶切位点太近，一个酶切完成以后另一个酶切位点基本上没有保护性碱基，另外可以再坚持下你的目的片段里有没这两个酶切位点，若是没有要不可以尝试载体酶切后去磷酸化，或换酶切位点。
赞一下(11人) 回复此楼
5楼2009-08-06 15:40:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
感受态细胞是没有问题的，做其他的转化都很好！
赞一下 回复此楼
一个人可以不成功，但不可以不成长！
6楼2009-08-06 15:44:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

wjw992008

银虫 (小有名气)
★ ★ ★
Anson1358(金币+1,VIP+0):片段短了连接效率高，很长就很难连了！ 8-6 18:20
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-6 19:44
这个~~
酶切回收后的载体及片断的质量是相当重要的，光键纯度要高一些。
连接之前测一测浓度及纯度，
如果质量还可以按照载体片断1：10进行连接，
双酶切连接效率还是挺高的，转化后可以达到80%阳性率。
赞一下(11人) 回复此楼
7楼2009-08-06 16:38:14
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

beisimai895

木虫 (小有名气)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):难度很大啊！哎！！！！！！！！！！ 8-6 18:22
做连接，关键是体系，即目的片段与载体的量要加对，而且粘连的话，应该没什么难度的，祝好运。
赞一下(1人) 回复此楼
8楼2009-08-06 17:22:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我的片段已经在一个原核表达载体上了！序列也已经知道了！我用PCR扩增后连接到其他载体上！还用测序吗？大家指点一下
赞一下 回复此楼
一个人可以不成功，但不可以不成长！
9楼2009-08-06 19:41:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

银杏下

金虫 (小有名气)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):我是说PCR扩增后连接到克隆载体后要不要测序！ 8-7 08:31
正常情况下可以不测序，因为DNA体内扩增突变率还是很低的。
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2009-08-06 20:31:53
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 Anson1358 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复 (可上传附件)
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 时间戳又变了8-15 +8 archvillain 2026-08-15 15/750 2026-08-15 16:23 by 医学老男孩
[基金申请] 欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律 +27 医学老男孩 2026-08-13 58/2900 2026-08-15 15:57 by GZUZM
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.5.4,科目全,可+急 +3 P4JhWrbJGjSe 2026-08-14 5/250 2026-08-15 15:46 by QXtWNz7PI7wZ
[论文投稿] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 15:10 by QXtWNz7PI7wZ
[硕博家园] 售SCI一区文章，我:8O5.5.1.O5.4,科目全,可伽急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 14:58 by QXtWNz7PI7wZ
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +4 HFw0lei2R37i 2026-08-14 8/400 2026-08-15 14:41 by QXtWNz7PI7wZ
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +7 majunge000 2026-08-11 9/450 2026-08-15 13:34 by kiz2011
[考博] 售一区SCI文章T0P，我:8O.551.O54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-15 11:41 by KxMI1BYBxWX1
[考研] 售SCI一区T0P文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可+急 +5 HFw0lei2R37i 2026-08-14 9/450 2026-08-15 11:33 by KxMI1BYBxWX1
[考博] 售SCI文章，我:8O.5.5.1O.54,科目全,可十急 +4 k0dTPqJtl0jt 2026-08-14 5/250 2026-08-15 04:45 by 4wMiSEwB6436
[硕博家园] 售SCI一区T0P文章，我:8.O55.1.O.54,科目全,可十急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 4/200 2026-08-15 04:17 by 4wMiSEwB6436
[教师之家] 售SCI一区文章，我:8.O.55.1.O.54,科目齐全,可伽急 +3 HFw0lei2R37i 2026-08-14 5/250 2026-08-14 22:32 by 4wMiSEwB6436
[基金申请] 我的国基提前知道中了，可是同事的操作让我实在接受不了，怎么会有这样的人 +10 家与远方 2026-08-10 15/750 2026-08-14 02:08 by 绵羊哥哥
[基金申请] 静等基金结果 +8 gjjjzhong 2026-08-10 21/1050 2026-08-13 17:56 by 且听虎啸
[基金申请] 重要来源：本周末出结果 +10 瞬息宇宙 2026-08-12 10/500 2026-08-13 15:46 by likettle
[基金申请] Filecode 又变了，巨变 +3 WH3796 2026-08-12 4/200 2026-08-13 14:13 by 小木虫6752397
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 13/650 2026-08-12 08:17 by yufeiwaner
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 国自然结果 +4 Vierhys 2026-08-10 8/400 2026-08-10 15:06 by Vierhys
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭