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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 救命！载体构建！
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢！ 8-7 08:32
不用测序！
但是，你要明白，普通的聚合酶扩增，都会有一定的突变率！虽然这个突变率很小！你要是做表达的话，建议用pfu酶！
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11楼2009-08-06 22:00:17
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)
我就是用普通的Taq酶扩增的！
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一个人可以不成功，但不可以不成长！
12楼2009-08-07 14:22:52
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plantst5928

铜虫 (小有名气)
★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流！ 8-29 20:47
可能是这2个酶切位点挨的太近了，好像只有5bp，不好切。NEB的网站建议：Double digest is not recommended. A sequential digest is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer.
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13楼2009-08-29 20:41:54
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melissaqin

铜虫 (小有名气)
你有没有考虑过连接的体系呢？T载体连接说明书上说16摄氏度连接，但从我自己的实验来看，16摄氏度连接一直都没有4℃连接过夜的效率好！你的目的片段比较大，所以连接起来也不是很容易，你可以试试看！
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14楼2009-08-29 20:55:22
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seabird06

铁杆木虫 (著名写手)
★
Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢啊！这个我倒是没有注意过！ 8-29 23:08
我最近在做连接的时候也连不上，后来发现一个问题！

就是双酶切后DNA切胶时紫外太强，所以怎么连都连不上，后来问了实验室其它老师才知道我们的紫外有三挡，后来跳到低档，也就是长波下再切胶时就连接成功了！！楼主再切胶的时候要注意这个情况！
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15楼2009-08-29 21:43:37
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spiderboy

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
楼主，你的片段连到原核载体上后，不能再用PCR去获取片段；而应该从你连上的那个原核载体上把片段切下来，这样得到的序列真实性才比较高。。实在切不下来才用PCR去获取，这是正规程序。
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16楼2009-08-30 09:39:05
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