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shensc727

金虫 (小有名气)


Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢! 8-7 08:32
不用测序!
但是,你要明白,普通的聚合酶扩增,都会有一定的突变率!虽然这个突变率很小!你要是做表达的话,建议用pfu酶!
11楼2009-08-06 22:00:17
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Anson1358

铁杆木虫 (著名写手)

我就是用普通的Taq酶扩增的!
一个人可以不成功,但不可以不成长!
12楼2009-08-07 14:22:52
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plantst5928

铜虫 (小有名气)

★ ★
amisking(金币+2,VIP+0):欢迎发帖交流! 8-29 20:47
可能是这2个酶切位点挨的太近了,好像只有5bp,不好切。NEB的网站建议:Double digest is not recommended. A sequential digest is required, using each enzyme in its supplied NEBuffer.
13楼2009-08-29 20:41:54
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melissaqin

铜虫 (小有名气)

你有没有考虑过连接的体系呢?T载体连接说明书上说16摄氏度连接,但从我自己的实验来看,16摄氏度连接一直都没有4℃连接过夜的效率好!你的目的片段比较大,所以连接起来也不是很容易,你可以试试看!
14楼2009-08-29 20:55:22
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seabird06

铁杆木虫 (著名写手)


Anson1358(金币+1,VIP+0):谢谢啊!这个我倒是没有注意过! 8-29 23:08
我最近在做连接的时候也连不上,后来发现一个问题!

就是双酶切后DNA切胶时紫外太强,所以怎么连都连不上,后来问了实验室其它老师才知道我们的紫外有三挡,后来跳到低档,也就是长波下再切胶时就连接成功了!!楼主再切胶的时候要注意这个情况!
15楼2009-08-29 21:43:37
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spiderboy

金虫 (正式写手)


小木虫(金币+0.5):给个红包,谢谢回帖交流
楼主,你的片段连到原核载体上后,不能再用PCR去获取片段;而应该从你连上的那个原核载体上把片段切下来,这样得到的序列真实性才比较高。。实在切不下来才用PCR去获取,这是正规程序。
16楼2009-08-30 09:39:05
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