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【求助】关于长片段PCR的几个问题【已成功解决！】
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6Kbp的片段在中间有一个碱基缺失突变，最近在尝试搭桥修复。遇到一系列的问题如下： 条件：高保真酶Pfu UItraII Fusion HS DNA聚合酶 （速度：10kb以下1kb/15s，不加A尾，我们用2min来延伸6kb。） 问题一：使用说明书的条件，3kb片段的扩增效果很好，但是对于6kb效果不是最优（用原6k模板对照，三个模板浓度只有一个有条带，但是非常亮了）。有没有人做过接近6kb的长片段PCR？ 问题二：搭桥的效果不好，两个片段拼接后再加两端引物没有扩增出6kb片段，甚至，几条片段都在1.5kb以下。有没有可能将DNA双链分开收集？即纯化有意义的两条单链。 问题三：高保真酶Pfu UItraII Fusion HS 的说明书上只有一句简单的“不能加A尾”，能否确定一个A都不会加？如可行，可以做单引物PCR。 问题四：单链DNA稳定性如何？ 问题五：能否在Agarose胶上将双链DNA和单链DNA分开？ [ Last edited by 咖啡加点盐7630 on 2009-8-10 at 02:10 ] |
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xiaoguniang
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2楼2009-08-04 10:51:50
greatsaint
银虫 (小有名气)
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3楼2009-08-04 10:56:05
★ ★
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):说明书上10kb以上体系才有变化。我要不能加A不是想接T，是想单引物PCR，要保证一个A都不加，以免引入A碱基突变。 8-4 15:05
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):说明书上10kb以上体系才有变化。我要不能加A不是想接T，是想单引物PCR，要保证一个A都不加，以免引入A碱基突变。 8-4 15:05
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
好像我记得这个酶扩增6个K以上是体系有变化的了，和短片段的实验体系不同的，第二个问题俺也不晓得，第三个问题它说的不能加A是说用Pfu扩出来的产物是3’平末端的，不能扩出来3’加A末端的产物，要连到T载体里面需要用Taq做一下3‘加A的操作。单连DNA不稳定，在胶上能不能分开就不知道了，没跑过，你可以跑下把结果告诉大家一下嘛 |
4楼2009-08-04 13:26:10
hyde0706
木虫 (正式写手)
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5楼2009-08-04 14:29:20
★ ★ ★
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-4 16:28
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):区域不能由我选，是基因发生一个碱基缺失突变了，必须在那里把它补回来。另外，我们要顺便摸索条件以作它用，还是尽量自己能变成高手更好^_^ 8-4 19:10
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
司马诸葛(金币+1,VIP+0):谢谢交流 8-4 16:28
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):区域不能由我选，是基因发生一个碱基缺失突变了，必须在那里把它补回来。另外，我们要顺便摸索条件以作它用，还是尽量自己能变成高手更好^_^ 8-4 19:10
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
| 按照这几天在宝生物做实验，有高手带我，高保真酶可以扩扩增15k的长链呢，所以没问题，还有引物设计没说呢么难度，依据参考序列设计引物就行了，不行就换个区域，这样几次就能扩增出来。再不行来大连宝生物做，高手估计一两天就给你扩出来，呵呵。 |
6楼2009-08-04 15:56:32
7楼2009-08-04 16:57:20
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
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8楼2009-08-04 17:07:50
9楼2009-08-04 19:12:18
houjinglhy
荣誉版主 (文坛精英)
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咖啡加点盐7630(金币+2,VIP+0):方法很诡异。虽然不明白原理，但既然是你们的经验，非常感谢提供，可以尝试一下！ 8-4 19:21
咖啡加点盐7630(金币+2,VIP+0):啊，想知道你们的模板浓度大概用多高？还有，你们搭桥的片段是多长？我们有成功搭桥小片段，但是现在做大片段的条件苛刻很多。。。 8-9 18:40
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:10
咖啡加点盐7630(金币+2,VIP+0):方法很诡异。虽然不明白原理，但既然是你们的经验，非常感谢提供，可以尝试一下！ 8-4 19:21
咖啡加点盐7630(金币+2,VIP+0):啊，想知道你们的模板浓度大概用多高？还有，你们搭桥的片段是多长？我们有成功搭桥小片段，但是现在做大片段的条件苛刻很多。。。 8-9 18:40
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:10
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问题2： 关于搭桥PCR 我们实验室有个心得可以提供楼主试下 常规的先上下游基因搭桥 再加两端引物的方法不是很高效 我们一般是把两个模版和两端引物在最初PCR的时候就放进去, 中间不停机，多P几个循环 这样效果比较好 |
10楼2009-08-04 19:15:38
