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汕头大学海洋科学接受调剂
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咖啡加点盐7630

金虫 (正式写手)

[交流] 【求助】关于长片段PCR的几个问题【已成功解决!】

6Kbp的片段在中间有一个碱基缺失突变,最近在尝试搭桥修复。遇到一系列的问题如下:

条件:高保真酶Pfu UItraII Fusion HS DNA聚合酶 (速度:10kb以下1kb/15s,不加A尾,我们用2min来延伸6kb。)

问题一:使用说明书的条件,3kb片段的扩增效果很好,但是对于6kb效果不是最优(用原6k模板对照,三个模板浓度只有一个有条带,但是非常亮了)。有没有人做过接近6kb的长片段PCR?

问题二:搭桥的效果不好,两个片段拼接后再加两端引物没有扩增出6kb片段,甚至,几条片段都在1.5kb以下。有没有可能将DNA双链分开收集?即纯化有意义的两条单链。

问题三:高保真酶Pfu UItraII Fusion HS 的说明书上只有一句简单的“不能加A尾”,能否确定一个A都不会加?如可行,可以做单引物PCR。

问题四:单链DNA稳定性如何?

问题五:能否在Agarose胶上将双链DNA和单链DNA分开?

[ Last edited by 咖啡加点盐7630 on 2009-8-10 at 02:10 ]
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All this for a loaf of bread?
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amilie030312

金虫 (正式写手)


咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功,发红包庆祝! 8-10 02:09
双链DNA变性成单链了不是很容易再旋到一起变成双链的吗?
7楼2009-08-04 16:57:20
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xiaoguniang

金虫 (小有名气)


咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功,发红包庆祝! 8-10 02:08
这么长的我也没扩过,我只扩过2kb的片段,用的普通酶,效果还可以,测序还行,但建议用高保真酶!你的问题我也不清楚,参与进来学习一下!
2楼2009-08-04 10:51:50
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greatsaint

银虫 (小有名气)


咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功,发红包庆祝! 8-10 02:09
我也想扩增个5-6kb的片段,但是没有引物,自己也不会设计,正愁呢。
3楼2009-08-04 10:56:05
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amilie030312

金虫 (正式写手)

★ ★
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):说明书上10kb以上体系才有变化。我要不能加A不是想接T,是想单引物PCR,要保证一个A都不加,以免引入A碱基突变。 8-4 15:05
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功,发红包庆祝! 8-10 02:09
好像我记得这个酶扩增6个K以上是体系有变化的了,和短片段的实验体系不同的,第二个问题俺也不晓得,第三个问题它说的不能加A是说用Pfu扩出来的产物是3’平末端的,不能扩出来3’加A末端的产物,要连到T载体里面需要用Taq做一下3‘加A的操作。单连DNA不稳定,在胶上能不能分开就不知道了,没跑过,你可以跑下把结果告诉大家一下嘛
4楼2009-08-04 13:26:10
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