| 查看: 1548 | 回复: 14 | |||
| 当前主题已经存档。 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
【求助】关于长片段PCR的几个问题【已成功解决！】
|
|||
|
6Kbp的片段在中间有一个碱基缺失突变，最近在尝试搭桥修复。遇到一系列的问题如下： 条件：高保真酶Pfu UItraII Fusion HS DNA聚合酶 （速度：10kb以下1kb/15s，不加A尾，我们用2min来延伸6kb。） 问题一：使用说明书的条件，3kb片段的扩增效果很好，但是对于6kb效果不是最优（用原6k模板对照，三个模板浓度只有一个有条带，但是非常亮了）。有没有人做过接近6kb的长片段PCR？ 问题二：搭桥的效果不好，两个片段拼接后再加两端引物没有扩增出6kb片段，甚至，几条片段都在1.5kb以下。有没有可能将DNA双链分开收集？即纯化有意义的两条单链。 问题三：高保真酶Pfu UItraII Fusion HS 的说明书上只有一句简单的“不能加A尾”，能否确定一个A都不会加？如可行，可以做单引物PCR。 问题四：单链DNA稳定性如何？ 问题五：能否在Agarose胶上将双链DNA和单链DNA分开？ [ Last edited by 咖啡加点盐7630 on 2009-8-10 at 02:10 ] |
回复此楼» 猜你喜欢
咱们一起用铁证分析2026国家社科基金中标与否
已经有17人回复
-
欢迎发来filecode的Mz6后的代码验证其规律
已经有47人回复
-
各位道友，我要去昆明玩几天，回来见。
已经有6人回复
-
奇怪，两个人的filecode固定段从头到尾一模一样
已经有11人回复
-
哪位老哥知道今年的国自然具体哪一天放榜？
已经有4人回复
-
有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验）
已经有8人回复
-
应该是93bebmhtak前后十一个字符比较关键
已经有37人回复
-
好奇怪的filecode
已经有7人回复
-
filecode
已经有9人回复
-
请教兼职经验
已经有3人回复
三磷酸腺苷
铁杆木虫 (职业作家)
- BioEPI: 3
- 应助: 1 (幼儿园)
- 贵宾: 0.021
- 金币: 7298.5
- 散金: 9
- 红花: 13
- 帖子: 4032
- 在线: 224.7小时
- 虫号: 551611
- 注册: 2008-04-27
- 性别: GG
- 专业: 神经系统肿瘤（含特殊感受
8楼2009-08-04 17:07:50
xiaoguniang
金虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 571
- 散金: 15
- 红花: 1
- 帖子: 155
- 在线: 40.8小时
- 虫号: 315295
- 注册: 2007-03-01
- 性别: MM
- 专业: 蔬菜学与瓜果学
2楼2009-08-04 10:51:50
greatsaint
银虫 (小有名气)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 390.8
- 散金: 10
- 帖子: 193
- 在线: 15.4小时
- 虫号: 587599
- 注册: 2008-08-22
- 性别: GG
- 专业: 环境微生物学
3楼2009-08-04 10:56:05
★ ★
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):说明书上10kb以上体系才有变化。我要不能加A不是想接T，是想单引物PCR，要保证一个A都不加，以免引入A碱基突变。 8-4 15:05
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):说明书上10kb以上体系才有变化。我要不能加A不是想接T，是想单引物PCR，要保证一个A都不加，以免引入A碱基突变。 8-4 15:05
咖啡加点盐7630(金币+1,VIP+0):6kbp成功，发红包庆祝！ 8-10 02:09
好像我记得这个酶扩增6个K以上是体系有变化的了，和短片段的实验体系不同的，第二个问题俺也不晓得，第三个问题它说的不能加A是说用Pfu扩出来的产物是3’平末端的，不能扩出来3’加A末端的产物，要连到T载体里面需要用Taq做一下3‘加A的操作。单连DNA不稳定，在胶上能不能分开就不知道了，没跑过，你可以跑下把结果告诉大家一下嘛 |
4楼2009-08-04 13:26:10
