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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助：重组质粒双酶切验证，电泳检测条带都偏大
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xj22667

银虫 (小有名气)

[交流] 求助：重组质粒双酶切验证，电泳检测条带都偏大

最近做一个克隆，用的是PET-28a载体（5369bp），目的片段约300bp，转化后挑斑提质粒，双酶切（BamH 1、Hind 3）后电泳检测条带都偏大(Maker为1kp和Maker1) 中间四个为酶切产物 最后一个为空载体回收作对照  
切了好几次都是这样   为什么啊 郁闷！
是不是克隆又失败了 恳求各位高人指点

[ Last edited by xj22667 on 2009-7-30 at 17:10 ]
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1楼 2009-07-30 17:02:14
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zhuangqli

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
不太懂，学习下
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2楼2009-07-30 17:03:58
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guotieying

银虫 (正式写手)
★ ★
司马诸葛(金币+2,VIP+0):谢谢交流 7-30 17:28
从你电泳的质量来看，比较差，因为试验中的每一个图片都有保存的价值。你的重组质粒跟空载比起来大（不从maker来看），说明质粒是重组成功的。但是却在目的片段附近看不到所需的酶切片段，1、你的重组质粒酶切不充分；2、目标片段太小，浓度不够；3、所提取的质粒质量比较差，所以导致了酶切不够或者失败。如果是用做论文的话，这个样子的酶切图是绝对用不成的，需要重新的组合，然后跑电泳拍照；4、假使原因2成立，那么你的浓度不够，大大增加了目标片段回收的难度，也给后续的操作曾加了很大的难度。
建议，重新提取质粒，或者是提纯质粒，然后再酶切。

[ Last edited by guotieying on 2009-7-30 at 17:15 ]
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本来无一物，何处惹尘埃。
3楼2009-07-30 17:09:46
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shensc727

金虫 (小有名气)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
三楼说的很对，多说一句，你的300片段有点短，不知道你的胶浓度是多大的？要是比较小浓度的胶的话，很容易分不开的！仅供参考！
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4楼2009-07-30 17:46:43
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xj22667

银虫 (小有名气)
途中在400那里隐约有条较淡的带  我用的胶是1%的  质粒是拿酚氯仿提的
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5楼2009-07-30 18:27:37
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
严重同意3楼和4楼!!!
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6楼2009-07-31 08:22:58
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glucidum

金虫 (正式写手)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
引用回帖:
Originally posted by xj22667 at 2009-7-30 18:27:
途中在400那里隐约有条较淡的带  我用的胶是1%的  质粒是拿酚氯仿提的

这个条带未必是400的,旁边的小Marker应该是受样品影响导致条带变形。
跑电泳时,loading buffer不要加的太多，我怀疑你样品中盐浓度太高,影响电泳结果了。
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7楼2009-07-31 08:25:46
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
有可能是片段有些短，在跑的过程中消失了，你跑电泳时刚开始时就看看在300、400的范围内有没有条带，要是没有的话就得好好考虑一下啊
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平和悦衲！
8楼2009-07-31 08:41:42
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michaelwuqingyu

金虫 (正式写手)
依据我的经验来看，你这个99%成功的克隆进去了，我看你前四个胶孔很亮，肯定是提取质粒有蛋白污染，正电荷的蛋白会和DNA结合，导致DNA跑不出去，也会让跑出去的DNA跑得慢些。另外，蛋白污染也会降低酶切效率，所以你酶切不完全，下面的条带DNA量很少，但是还是可以清晰地看到条带，应该没问题。你的问题就是plasmid 提取有问题，用好点的kit吧。你的胶跑成这样，我怀疑电压也有点大，产生热量太多，让胶变形，下次试着用小点电压。好运。
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9楼2009-07-31 09:43:25
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xj22667

银虫 (小有名气)
感谢大家的分析 很有道理的 我再提质粒检测一次 3Q
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10楼2009-07-31 10:56:14
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