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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 核酸提取 » 求助帖：质粒提取摇菌失败求助
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Sily2020

新虫 (小有名气)

[求助] 求助帖：质粒提取摇菌失败求助 已有1人参与

新手第一次做质粒转化，挑菌、提取，做的是PNL-4-3这个质粒，转化使用热激法，质粒+感受态细胞stbl3结合冰浴30min,热激90s，在冰浴2min，加1ml的无抗LB培养基，摇1h，取10ml菌液铺固体培养基，虽然长菌挺密，但可挑出单菌落，然后10ml有抗培养基摇菌，摇了20管，过夜摇菌，浑浊了，然后用天根大抽提试剂盒，富集了将近200ml的菌体，严格按照说明书做，但最后提取出的质粒浓度不到50ng/ul，纯度OD260/280大于2，为什么呢？希望各位虫友解答一下，感谢

求助帖：质粒提取摇菌失败求助


求助帖：质粒提取摇菌失败求助-1


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1楼 2021-01-22 11:22:54
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
挑克隆后先用5毫升摇菌，保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。

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3楼2021-01-22 13:07:47
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wshdhr8

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗
...

还有，试剂盒的洗涤buff要加无水乙醇的

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10楼2021-01-23 18:35:08
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普通回帖

wshdhr8

铁虫 (小有名气)
菌液摇的不够浑，试管摇不开，用锥形瓶

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2楼2021-01-22 11:29:26
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snoopyzxx

木虫 (著名写手)
还有涂平板，如果是质粒转化，涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的？

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4楼2021-01-22 13:08:51
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爱吃排骨199

铁虫 (小有名气)
同意某楼，1mL LB复苏培养后离心弃900微升，剩余的重悬菌体沉淀涂板，你的为什么是10mL
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5楼2021-01-22 14:50:32
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Sily2020

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:07:47
挑克隆后先用5毫升摇菌，保种一毫升。剩下的四毫升提取质粒电泳鉴定。不要一来就大抽。小的证明没问题再大抽。

我们实验室没有做质粒电泳的机器，所以没法验证，只能大提

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6楼2021-01-23 15:15:08
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Sily2020

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by snoopyzxx at 2021-01-22 13:08:51
还有涂平板，如果是质粒转化，涂100-200微升菌夜就够了。你10毫升怎么涂的？

说错了，我用的是10ul涂板的，之前用的是100-200但每次都长满培养皿了

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7楼2021-01-23 15:15:59
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Sily2020

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by wshdhr8 at 2021-01-22 11:29:26
菌液摇的不够浑，试管摇不开，用锥形瓶

那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗

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8楼2021-01-23 15:19:00
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wshdhr8

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by Sily2020 at 2021-01-23 15:19:00
那我是先用试管摇10ml，浑浊后，抽5ml，放锥形瓶摇100ml，可以吗
...

挑斑可以直接加到锥形瓶里摇培，过夜能摇浑。你说的先用试管活化一下，试管太细，加的LB不宜太多，2-3-4毫升这个水平，白天摇几个小时微浑，然后1：500   1：1000加到锥形瓶里过夜都行，只要方法对了，都能做出来。

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9楼2021-01-23 18:33:22
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