应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pfu 的pcr问题
251/3返回列表123下一页
查看: 962  |  回复: 24
只看楼主@他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看
当前主题已经存档。

381466632

木虫 (正式写手)

[交流] pfu 的pcr问题

每次都p出来两条带，但是我的目的条带很弱，回收不出来。请教一下怎样可以增强我的目的，减少非特异性条带？谢谢。我用的是65 退火1分钟，延伸1分30秒。28循环。
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼2009-07-28 08:05:11
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

witch-dj

木虫 (著名写手)

快乐家族-witchdj
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
延伸时间增长为3min，退火温度在调节一下，根据引物的Tm值，试试看
赞一下(3人) 回复此楼
2楼2009-07-28 08:09:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

fz-xyz

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0):谢谢， 7-28 14:53
两条带的话可以用oligo看看到底是哪里的错配，之后修改Tm值。
或者直接尝试不同Tm值。
退火时间应该是根据目的条带长短确定的啊~
赞一下(3人) 回复此楼
追求科学
3楼2009-07-28 08:45:20
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

hyde0706

木虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
首先考虑降低退火温度，可以提高扩增效率。适当增加延伸时间，不过这个效果不是很明显。可以增加一些PCR增强剂，甘油可以抑制非特异扩增，BSA可以提高扩增效率。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2009-07-28 10:51:52
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

381466632

木虫 (正式写手)
我用65度可以p出来，我得条带大小为2kd左右。加了甘油之后我得目的不见了，只有一个了。
赞一下 回复此楼
5楼2009-07-28 13:06:51
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by witch-dj at 2009-7-28 08:09:
延伸时间增长为3min，退火温度在调节一下，根据引物的Tm值，试试看

谢谢，我先试试
回复此楼
6楼2009-07-28 14:49:37
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fz-xyz at 2009-7-28 08:45:
两条带的话可以用oligo看看到底是哪里的错配，之后修改Tm值。
或者直接尝试不同Tm值。
退火时间应该是根据目的条带长短确定的啊~

首先谢谢你，可不可以把oligo看错配说得详细点，学习一下。还有我的扩增条带1900左右。退火时间需要延长吗？
赞一下 回复此楼
7楼2009-07-28 14:51:46
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2009-7-28 10:51:
首先考虑降低退火温度，可以提高扩增效率。适当增加延伸时间，不过这个效果不是很明显。可以增加一些PCR增强剂，甘油可以抑制非特异扩增，BSA可以提高扩增效率。

甘油我加了百分之十，扩出来的条带没有我得目的。
赞一下 回复此楼
8楼2009-07-28 14:52:52
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦
★
381466632(金币+1):谢谢参与
减少非特异性应该升高退货，另外看你的目的条带是多大的，杂带如果较小可以增加时间，杂带大就减少退火时间。
还可以略微减少引物用量，减少错配
赞一下(1人) 回复此楼
低调潜行
9楼2009-07-28 14:59:31
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

ytetyio09

新虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1):谢谢参与
obviously, your extension time is too short, use 4-5min, have a try again. Because the speed of PFU amplification is about 500bp/min.

your annealing time is more than enough.

[ Last edited by ytetyio09 on 2009-7-28 at 15:21 ]
赞一下(1人) 回复此楼
10楼2009-07-28 15:20:03
 已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 381466632 的主题更新
251/3返回列表123下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫 高级回复(可上传附件)
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭