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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pfu 的pcr问题
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381466632

木虫 (正式写手)

[交流] pfu 的pcr问题

每次都p出来两条带，但是我的目的条带很弱，回收不出来。请教一下怎样可以增强我的目的，减少非特异性条带？谢谢。我用的是65 退火1分钟，延伸1分30秒。28循环。
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1楼 2009-07-28 08:05:11
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witch-dj

木虫 (著名写手)

快乐家族-witchdj
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
延伸时间增长为3min，退火温度在调节一下，根据引物的Tm值，试试看
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2楼2009-07-28 08:09:20
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fz-xyz

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0):谢谢， 7-28 14:53
两条带的话可以用oligo看看到底是哪里的错配，之后修改Tm值。
或者直接尝试不同Tm值。
退火时间应该是根据目的条带长短确定的啊~
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追求科学
3楼2009-07-28 08:45:20
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
首先考虑降低退火温度，可以提高扩增效率。适当增加延伸时间，不过这个效果不是很明显。可以增加一些PCR增强剂，甘油可以抑制非特异扩增，BSA可以提高扩增效率。
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4楼2009-07-28 10:51:52
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381466632

木虫 (正式写手)
我用65度可以p出来，我得条带大小为2kd左右。加了甘油之后我得目的不见了，只有一个了。
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5楼2009-07-28 13:06:51
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381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by witch-dj at 2009-7-28 08:09:
延伸时间增长为3min，退火温度在调节一下，根据引物的Tm值，试试看

谢谢，我先试试
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6楼2009-07-28 14:49:37
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381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by fz-xyz at 2009-7-28 08:45:
两条带的话可以用oligo看看到底是哪里的错配，之后修改Tm值。
或者直接尝试不同Tm值。
退火时间应该是根据目的条带长短确定的啊~

首先谢谢你，可不可以把oligo看错配说得详细点，学习一下。还有我的扩增条带1900左右。退火时间需要延长吗？
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7楼2009-07-28 14:51:46
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381466632

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by hyde0706 at 2009-7-28 10:51:
首先考虑降低退火温度，可以提高扩增效率。适当增加延伸时间，不过这个效果不是很明显。可以增加一些PCR增强剂，甘油可以抑制非特异扩增，BSA可以提高扩增效率。

甘油我加了百分之十，扩出来的条带没有我得目的。
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8楼2009-07-28 14:52:52
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米见方ggsddu

金虫 (小有名气)

only屋里哇啦
★
381466632(金币+1):谢谢参与
减少非特异性应该升高退货，另外看你的目的条带是多大的，杂带如果较小可以增加时间，杂带大就减少退火时间。
还可以略微减少引物用量，减少错配
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低调潜行
9楼2009-07-28 14:59:31
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1):谢谢参与
obviously, your extension time is too short, use 4-5min, have a try again. Because the speed of PFU amplification is about 500bp/min.

your annealing time is more than enough.

[ Last edited by ytetyio09 on 2009-7-28 at 15:21 ]
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10楼2009-07-28 15:20:03
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