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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » pfu 的pcr问题
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381466632

木虫 (正式写手)

[交流] pfu 的pcr问题

每次都p出来两条带，但是我的目的条带很弱，回收不出来。请教一下怎样可以增强我的目的，减少非特异性条带？谢谢。我用的是65 退火1分钟，延伸1分30秒。28循环。
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1楼 2009-07-28 08:05:11
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ytetyio09

新虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1):谢谢参与
obviously, your extension time is too short, use 4-5min, have a try again. Because the speed of PFU amplification is about 500bp/min.

your annealing time is more than enough.

[ Last edited by ytetyio09 on 2009-7-28 at 15:21 ]
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10楼2009-07-28 15:20:03
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witch-dj

木虫 (著名写手)

快乐家族-witchdj
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
延伸时间增长为3min，退火温度在调节一下，根据引物的Tm值，试试看
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2楼2009-07-28 08:09:20
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fz-xyz

银虫 (小有名气)
★ ★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
381466632(金币+1,VIP+0):谢谢， 7-28 14:53
两条带的话可以用oligo看看到底是哪里的错配，之后修改Tm值。
或者直接尝试不同Tm值。
退火时间应该是根据目的条带长短确定的啊~
赞一下(3人) 回复此楼
追求科学
3楼2009-07-28 08:45:20
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hyde0706

木虫 (正式写手)
★
381466632(金币+1,VIP+0): 7-28 14:53
首先考虑降低退火温度，可以提高扩增效率。适当增加延伸时间，不过这个效果不是很明显。可以增加一些PCR增强剂，甘油可以抑制非特异扩增，BSA可以提高扩增效率。
赞一下(2人) 回复此楼
4楼2009-07-28 10:51:52
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