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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 微生物 » 发酵/表达 » 质粒pYES2转化酵母没有转化子出现
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飞不动D鸟

新虫 (初入文坛)

[交流] 质粒pYES2转化酵母没有转化子出现

各位前辈：
      我最近在做酵母的转化实验，用到两个质粒一个是cas9质粒一个是pYES2质粒，用醋酸锂转化法，具体方法如下：
1.        挑取单克隆酵母BY4741于10 ml YPD培养基中，30℃，250 rpm过夜培养。
2.        测定过夜培养之后的OD600，转接于50 ml YPD培养基中，使初始OD600=0.4，细胞数目约为5×106 。继续培养2-4 h，使OD600=1.3-1.5，细胞个数约为2×107。
3.        用50 ml 离心管，2500 rpm，5 min 离心，收集菌体，在40 ml 1×TE悬浮。
4.        2500 rpm，5 min 离心，去上清，收集菌体重悬于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。
5.        在室温下静置10 min。
6.        然后依次加入1 μg的质粒，100 μl的酵母悬液，700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE，剧烈振荡1 min 。在30℃情况下孵育30 min。
7.        加入88 μl DMSO，混匀，在42℃下热激7min（或20 min-25 min）
8.        2500 rpm ，5 min 离心，去除上清，在200 μl 1× TE中重悬。
9.        涂布于选择培养基含有G418的培养基（G418浓度：200 μg/ml）
10.        将平板在30 ℃培养2-3天。
可是连着做了几次了平板上都没有转化子出现，想问下大家问题出在哪里了，或者有什么可以改进的地方吗.
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1楼 2020-09-11 11:45:18
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
★
飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
菌株确定没问题吧，转化平板没问题吧

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3楼2020-09-12 00:08:04
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飞不动D鸟

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2020-09-12 00:08:04
菌株确定没问题吧，转化平板没问题吧

菌株没问题的吧，筛选培养基用的SD-Ura,加了2%的葡萄糖溶液。就是筛不出来

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7楼2020-09-17 10:24:00
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1142338573

新虫 (正式写手)
祝好运

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8楼2021-12-23 06:51:58
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tzynew2楼
2020-09-11 12:54   回复  
飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
1
斓曦20194楼
2020-09-12 06:25   回复  
飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
。 发自小木虫Android客户端
nono20095楼
2020-09-12 16:25   回复  
飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
·
miaojiabing6楼
2020-09-14 08:17   回复  
飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
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