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飞不动D鸟

新虫 (初入文坛)


[交流] 质粒pYES2转化酵母没有转化子出现

各位前辈:
      我最近在做酵母的转化实验,用到两个质粒一个是cas9质粒一个是pYES2质粒,用醋酸锂转化法,具体方法如下:
1.        挑取单克隆酵母BY4741于10 ml YPD培养基中,30℃,250 rpm过夜培养。
2.        测定过夜培养之后的OD600,转接于50 ml YPD培养基中,使初始OD600=0.4,细胞数目约为5×106 。继续培养2-4 h,使OD600=1.3-1.5,细胞个数约为2×107。
3.        用50 ml 离心管,2500 rpm,5 min 离心,收集菌体,在40 ml 1×TE悬浮。
4.        2500 rpm,5 min 离心,去上清,收集菌体重悬于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。
5.        在室温下静置10 min。
6.        然后依次加入1 μg的质粒,100 μl的酵母悬液,700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE,剧烈振荡1 min 。在30℃情况下孵育30 min。
7.        加入88 μl DMSO,混匀,在42℃下热激7min(或20 min-25 min)
8.        2500 rpm ,5 min 离心,去除上清,在200 μl 1× TE中重悬。
9.        涂布于选择培养基含有G418的培养基(G418浓度:200 μg/ml)
10.        将平板在30 ℃培养2-3天。
可是连着做了几次了平板上都没有转化子出现,想问下大家问题出在哪里了,或者有什么可以改进的地方吗.
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1142338573

新虫 (正式写手)


8楼2021-12-23 06:51:58
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查看全部 8 个回答

biosci

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飞不动D鸟(金币+1): 谢谢参与
菌株确定没问题吧,转化平板没问题吧

发自小木虫Android客户端
3楼2020-09-12 00:08:04
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飞不动D鸟

新虫 (初入文坛)


引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2020-09-12 00:08:04
菌株确定没问题吧,转化平板没问题吧

菌株没问题的吧,筛选培养基用的SD-Ura,加了2%的葡萄糖溶液。就是筛不出来

发自小木虫Android客户端
7楼2020-09-17 10:24:00
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简单回复
2020-09-12 06:25   回复  
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