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飞不动D鸟

新虫 (初入文坛)

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虫号: 19918229

[交流] 质粒pYES2转化酵母没有转化子出现

各位前辈：
我最近在做酵母的转化实验，用到两个质粒一个是cas9质粒一个是pYES2质粒，用醋酸锂转化法，具体方法如下：
1. 挑取单克隆酵母BY4741于10 ml YPD培养基中，30℃，250 rpm过夜培养。
2. 测定过夜培养之后的OD600，转接于50 ml YPD培养基中，使初始OD600=0.4，细胞数目约为5×106 。继续培养2-4 h，使OD600=1.3-1.5，细胞个数约为2×107。
3. 用50 ml 离心管，2500 rpm，5 min 离心，收集菌体，在40 ml 1×TE悬浮。
4. 2500 rpm，5 min 离心，去上清，收集菌体重悬于2 ml 1×LiAc/0.5 TE 中。
5. 在室温下静置10 min。
6. 然后依次加入1 μg的质粒，100 μl的酵母悬液，700 μl 1×LiAc/40%PEG3350/1×TE，剧烈振荡1 min 。在30℃情况下孵育30 min。
7. 加入88 μl DMSO，混匀，在42℃下热激7min（或20 min-25 min）
8. 2500 rpm ，5 min 离心，去除上清，在200 μl 1× TE中重悬。
9. 涂布于选择培养基含有G418的培养基（G418浓度：200 μg/ml）
10. 将平板在30 ℃培养2-3天。
可是连着做了几次了平板上都没有转化子出现，想问下大家问题出在哪里了，或者有什么可以改进的地方吗.

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