| 查看: 769 | 回复: 5 | ||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者quejing26将赠送您 100 个金币 | ||
[求助]
Inverse—PCR 已有1人参与
|
||
|
之前实验室一直用inversespcr定位外缘插入片段，我们是做植物，最近一个月，一直做不出来，跑胶全是空白，酶以及其他试剂几乎换了个遍，就是不行，大家有没有遇到类似情况，求助！ @wizardfan @biostar2009 发自小木虫IOS客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
含氟糖皮质激素的外用抗炎利器醋酸氟轻松
已经有0人回复
-
阿莫奈韦（Amenamevir）：解旋酶-引物酶靶向分子的结构特征与合成路径全解析
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有73人回复
-
利瑞鲁单抗：靶向KIR的NK细胞检查点工具抗体，结构基础与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Wnt-C59：PORCN靶向化学探针，Wnt信号通路阻断机制与科研应用全解析
已经有0人回复
-
Fexaramine：肠道限制性FXR化学探针，结构特征与信号通路研究全解析
已经有0人回复
-
NVS-STG2：靶向STING跨膜域的分子胶类激动剂，结构特征与寡聚化机制研究全解析
已经有0人回复
-
DOTA-GPC3肽（CAS 3066439-94-6）：双功能分子探针前体的结构特征与标记应用解析
已经有0人回复
-
科研用 TLR7/8 双激动剂怎么选？现货与质控要点
已经有0人回复
-
SEL120-34A HCl：CDK8/CDK19高选择性激酶抑制剂
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
2楼2020-07-30 09:21:39
3楼2020-07-30 09:24:22
【答案】应助回帖
|
首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
4楼2020-07-30 09:24:53
|
谢谢回答，不是很会用小木虫，抱歉才看到，整个体系之前实验室做了一年，非常成熟，师兄带我做的，后来师兄毕业了，我们是做很多独立样品，而且是四碱基酶，所以做一次二十多个样品，如果成功的话不会一个也做不出来，各种试剂没有问题，酶和引物都用新的，循环我也用的55度，我还会进行二次循环，用58度，最近一直在做，还是不行，有点气馁了 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2020-12-24 22:26:39
6楼2021-10-12 10:52:46