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Inverse—PCR 已有1人参与
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之前实验室一直用inversespcr定位外缘插入片段，我们是做植物，最近一个月，一直做不出来，跑胶全是空白，酶以及其他试剂几乎换了个遍，就是不行，大家有没有遇到类似情况，求助！ @wizardfan @biostar2009 发自小木虫IOS客户端 |
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【答案】应助回帖
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首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
4楼2020-07-30 09:24:53
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
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首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
2楼2020-07-30 09:21:39
3楼2020-07-30 09:24:22
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谢谢回答，不是很会用小木虫，抱歉才看到，整个体系之前实验室做了一年，非常成熟，师兄带我做的，后来师兄毕业了，我们是做很多独立样品，而且是四碱基酶，所以做一次二十多个样品，如果成功的话不会一个也做不出来，各种试剂没有问题，酶和引物都用新的，循环我也用的55度，我还会进行二次循环，用58度，最近一直在做，还是不行，有点气馁了 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2020-12-24 22:26:39
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