| 查看: 847 | 回复: 5 | |||
| 【悬赏金币】回答本帖问题，作者quejing26将赠送您 100 个金币 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[求助]
Inverse—PCR 已有1人参与
|
|||
|
之前实验室一直用inversespcr定位外缘插入片段，我们是做植物，最近一个月，一直做不出来，跑胶全是空白，酶以及其他试剂几乎换了个遍，就是不行，大家有没有遇到类似情况，求助！ @wizardfan @biostar2009 发自小木虫IOS客户端 |
回复此楼» 猜你喜欢
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有200人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
-
恩诺沙星（Enrofloxacin）科研解析：分子特征、LC-MS/MS 检测与实验室使用要点
已经有0人回复
-
Calderasib理化性质与实验操作技术笔记
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
|
谢谢回答，不是很会用小木虫，抱歉才看到，整个体系之前实验室做了一年，非常成熟，师兄带我做的，后来师兄毕业了，我们是做很多独立样品，而且是四碱基酶，所以做一次二十多个样品，如果成功的话不会一个也做不出来，各种试剂没有问题，酶和引物都用新的，循环我也用的55度，我还会进行二次循环，用58度，最近一直在做，还是不行，有点气馁了 发自小木虫IOS客户端 |
5楼2020-12-24 22:26:39
【答案】应助回帖
感谢参与，应助指数 +1
|
首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
2楼2020-07-30 09:21:39
3楼2020-07-30 09:24:22
【答案】应助回帖
|
首先 这类实验你一定要确定不是技术问题， 最好的方法是 你找个做过inverse pcr的人带你做 我以前也是做一个月做不出来 后来发现是酶坏了（被师弟放在室温下太久了，变质了）。 后来发现pcr cycles温度不太对（92-55-72）。 后来发现跑胶的染料变质，染不上去。 最后找个分子生物学专家帮忙才顺利解决。 你一定要找个曾经成功过的人带你，而且要先确认你的所有材料都是好的，技术环节不出错 其次 即使技术环节不出错， inverse pcr这个技术本身， 也未必可以成功。 这个纯粹看运气， 你定位插入的地方， 如果距离切割（限制性内切酶）的地方太远， 比如2w个base pairs（有点夸张的比喻）， 那你肯定pcr不成。 这种情况要做full genome sequence，烧钱是唯一的办法。 |
4楼2020-07-30 09:24:53
