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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 载体构建
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1772701

新虫 (初入文坛)
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载体构建
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我有一个400bp和882bp的片段需要构建过表达载体，但是现在基因一直扩不出来！！感觉要疯了，使用的是酶切位点?cds序列前后20bp的引物，现在梯度也试了，要么是没条带要么就是扩不出目的条带！用的日本晴种子cDNA，两个基因都在根和种子中表达，现在不想扩了根本不知道怎么办了！是我酶切位点找的有问题吗 都是直接网上搜的 引物是去掉了酶切位点后面的保护碱基?20bp 这么一个序列 F和R都是这个方法设计的。希望各位路过的大佬给点意见和建议！！！

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1楼 2020-05-23 22:40:39
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等你的时候

新虫 (初入文坛)
★
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基因扩不出，和酶切位点没有关系，应该从模板和扩增上找原因

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12楼2020-05-24 06:59:13
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glowinthesky

新虫 (初入文坛)
不想扩了直接找公司合成呗，这么小的片段又不贵。舍不得钱就用gDNA扩了拼起来。gDNA也扩不出，那你得重新学学引物设计了
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13楼2020-10-14 16:55:44
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)
★
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同上，合成或者公司亚克隆。自己不熟悉的话可能很久才做出来

实在是要自己P，比如以后分子实验做很多的话往下看。
1.先做个阳性对照确定cDNA、反应条件没问题，选一个曾经P出来的基因一起P

2.增大容错率，力所能及的使用最好的酶

3.引物不止看20bp，看具体tm值。也可去NCBI上尝试blast

4.多找几个引物对
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14楼2020-10-15 19:22:08
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yuying0421

新虫 (职业作家)
★
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先看看找的序列对不对，各个数据库注释不一样。

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15楼2021-02-05 22:50:45
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herethere2楼
2020-05-23 22:41   回复  
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立林2583693楼
2020-05-23 22:42   回复  
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stupidboy234楼
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HK驱魔者5楼
2020-05-23 22:43   回复  
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abc8765244086楼
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黑不溜秋珍7楼
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秋土豆香8楼
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快乐小磁场9楼
2020-05-23 22:49   回复  
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SunLapse10楼
2020-05-23 22:53   回复  
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xg111111楼
2020-05-23 22:58   回复  
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