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1772701

新虫 (初入文坛)


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载体构建
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我有一个400bp和882bp的片段需要构建过表达载体,但是现在基因一直扩不出来!!感觉要疯了,使用的是酶切位点?cds序列前后20bp的引物,现在梯度也试了,要么是没条带要么就是扩不出目的条带!用的日本晴种子cDNA,两个基因都在根和种子中表达,现在不想扩了根本不知道怎么办了!是我酶切位点找的有问题吗 都是直接网上搜的 引物是去掉了酶切位点后面的保护碱基?20bp 这么一个序列 F和R都是这个方法设计的。希望各位路过的大佬给点意见和建议!!!

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新虫 (初入文坛)


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基因扩不出,和酶切位点没有关系,应该从模板和扩增上找原因

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12楼2020-05-24 06:59:13
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glowinthesky

新虫 (初入文坛)


不想扩了直接找公司合成呗,这么小的片段又不贵。舍不得钱就用gDNA扩了拼起来。gDNA也扩不出,那你得重新学学引物设计了
13楼2020-10-14 16:55:44
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赵鑫易

铜虫 (小有名气)


★
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同上,合成或者公司亚克隆。自己不熟悉的话可能很久才做出来

实在是要自己P,比如以后分子实验做很多的话往下看。
1.先做个阳性对照确定cDNA、反应条件没问题,选一个曾经P出来的基因一起P

2.增大容错率,力所能及的使用最好的酶

3.引物不止看20bp,看具体tm值。也可去NCBI上尝试blast

4.多找几个引物对
14楼2020-10-15 19:22:08
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yuying0421

新虫 (职业作家)


★
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先看看找的序列对不对,各个数据库注释不一样。

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15楼2021-02-05 22:50:45
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herethere2楼
2020-05-23 22:41   回复  
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SunLapse10楼
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xg111111楼
2020-05-23 22:58   回复  
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