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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求教！急！qPCR内参Ct值高至35！但之前同样的手法都能跑出来Ct18-19！
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渔人图图

新虫 (小有名气)

[求助] 求教！急！qPCR内参Ct值高至35！但之前同样的手法都能跑出来Ct18-19！ 已有1人参与

最近提取小鼠肝细胞AML12的RNA 进行逆转，之后荧光实时PCR。在居家办公之前，内参MPPIA的Ct值有18-19左右，target gene大概26-28左右，都有比较好的扩增曲线和溶解曲线。但是自复工以来，同样提取得到的RNA，逆转之后跑实时PCR，内参MPPIA的Ct值都已经33以上，甚至高于35，或压根undetermined；target gene全部都是undetermined，溶解曲线根本不规则。

同样的手法，同样的Trizol提取方式，实在不知道是怎么回事了。目前出现这种情况已经三次，用别人的RNA sample可以跑出内参及target gene。所以怀疑是RNA样品出问题，但是今天又一次仔仔细细用Trizol提取RNA，包括*头重新灭菌，所用试剂全部换新的，再三确定无误，结果依旧不行，内参已经30好几，target gene依然undetermined。注：RNA浓度有300ng/ul左右（溶于20ulDEPC），260/280有1.8左右。

已经3次了。。同实验室的前辈也不知道是什么原因导致。。希望大神们能指点一二啊！拜谢！@biostar2009@biostar2009@wizardfan@飞约疯人院
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1楼 2020-05-09 05:21:08
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

owl2010

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:21
两个方面：反转录试剂可或者做定量的试剂不行了。检查一下提取的RNA样本跑一下胶，没问题的话自己再跑一下普通pcr，用actin引物试试你新反转录的cDNA，跑胶看看，啥都没有说明反转录不成功，换反转录试剂吧，如果cDNA没问题，换跑定量的试剂。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
4楼2020-05-09 14:25:50
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owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 渔人图图 at 2020-05-09 19:17:59
好的 谢谢您！今天又提了一次RNA 等下qPCR 同时还拿了别人的RNA样品 从逆转开始 再一起qPCR 看结果了 如果别人的正常 我的不正常 那就是RNA问题了。。...

为什么提取的RNA不先跑一下胶看看呢？万一降解了后续都不用做了。
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男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
7楼2020-05-09 19:36:21
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普通回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:09
这种情况下，考虑换定量试剂

发自小木虫Android客户端
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日拱一卒，功不唐捐
2楼2020-05-09 07:51:34
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渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Crescendo at 2020-05-09 07:51:34
这种情况下，考虑换定量试剂

您好 请问定量试剂是指？

发自小木虫IOS客户端
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3楼2020-05-09 13:09:49
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试剂放久了，性能下降了？
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行至水穷处，坐看云起时
5楼2020-05-09 15:05:04
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渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by owl2010 at 2020-05-09 14:25:50
两个方面：反转录试剂可或者做定量的试剂不行了。检查一下提取的RNA样本跑一下胶，没问题的话自己再跑一下普通pcr，用actin引物试试你新反转录的cDNA，跑胶看看，啥都没有说明反转录不成功，换反转录试剂吧，如果cD ...

好的 谢谢您！今天又提了一次RNA 等下qPCR 同时还拿了别人的RNA样品 从逆转开始 再一起qPCR 看结果了 如果别人的正常 我的不正常 那就是RNA问题了。。
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6楼2020-05-09 19:17:59
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渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by owl2010 at 2020-05-09 19:36:21
为什么提取的RNA不先跑一下胶看看呢？万一降解了后续都不用做了。...

主要是不太相信是降解 我之前都这样提 别人也是这样 所以还是抱有侥幸 今天先再试一次 如果还是不好 再去跑胶吧 真降解的话 这降解的原因也蒙圈 因为枪头试剂已经全部换了
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8楼2020-05-09 20:57:29
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QBLiqibing

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:44
若你的基因本来丰度比较低，可以考虑环境条件，你实验时周围是否还有其他操作质粒等实验
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9楼2020-05-10 11:32:32
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渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by QBLiqibing at 2020-05-10 11:32:32
若你的基因本来丰度比较低，可以考虑环境条件，你实验时周围是否还有其他操作质粒等实验

没有。今天等会跑胶，看结果吧。
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10楼2020-05-10 18:16:45
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