应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 求教！急！qPCR内参Ct值高至35！但之前同样的手法都能跑出来Ct18-19！
161/2返回列表12下一页
查看: 7537  |  回复: 15
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

渔人图图

新虫 (小有名气)

[求助] 求教！急！qPCR内参Ct值高至35！但之前同样的手法都能跑出来Ct18-19！ 已有1人参与

最近提取小鼠肝细胞AML12的RNA 进行逆转，之后荧光实时PCR。在居家办公之前，内参MPPIA的Ct值有18-19左右，target gene大概26-28左右，都有比较好的扩增曲线和溶解曲线。但是自复工以来，同样提取得到的RNA，逆转之后跑实时PCR，内参MPPIA的Ct值都已经33以上，甚至高于35，或压根undetermined；target gene全部都是undetermined，溶解曲线根本不规则。

同样的手法，同样的Trizol提取方式，实在不知道是怎么回事了。目前出现这种情况已经三次，用别人的RNA sample可以跑出内参及target gene。所以怀疑是RNA样品出问题，但是今天又一次仔仔细细用Trizol提取RNA，包括*头重新灭菌，所用试剂全部换新的，再三确定无误，结果依旧不行，内参已经30好几，target gene依然undetermined。注：RNA浓度有300ng/ul左右（溶于20ulDEPC），260/280有1.8左右。

已经3次了。。同实验室的前辈也不知道是什么原因导致。。希望大神们能指点一二啊！拜谢！@biostar2009@biostar2009@wizardfan@飞约疯人院
回复此楼

» 猜你喜欢

» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
1楼 2020-05-09 05:21:08
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

owl2010

金虫 (正式写手)
★ ★ ★
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:21
两个方面：反转录试剂可或者做定量的试剂不行了。检查一下提取的RNA样本跑一下胶，没问题的话自己再跑一下普通pcr，用actin引物试试你新反转录的cDNA，跑胶看看，啥都没有说明反转录不成功，换反转录试剂吧，如果cDNA没问题，换跑定量的试剂。
赞一下(2人) 回复此楼
男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
4楼2020-05-09 14:25:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

owl2010

金虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 渔人图图 at 2020-05-09 19:17:59
好的 谢谢您！今天又提了一次RNA 等下qPCR 同时还拿了别人的RNA样品 从逆转开始 再一起qPCR 看结果了 如果别人的正常 我的不正常 那就是RNA问题了。。...

为什么提取的RNA不先跑一下胶看看呢？万一降解了后续都不用做了。
赞一下(1人) 回复此楼
男人的组成要素:金钱、面子、性、怕死、自恋、吹牛逼。
7楼2020-05-09 19:36:21
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
普通回帖

Crescendo

铁杆木虫 (著名写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:09
这种情况下，考虑换定量试剂

发自小木虫Android客户端
赞一下 回复此楼
日拱一卒，功不唐捐
2楼2020-05-09 07:51:34
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Crescendo at 2020-05-09 07:51:34
这种情况下，考虑换定量试剂

您好 请问定量试剂是指？

发自小木虫IOS客户端
赞一下 回复此楼
3楼2020-05-09 13:09:49
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
试剂放久了，性能下降了？
赞一下 回复此楼
行至水穷处，坐看云起时
5楼2020-05-09 15:05:04
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by owl2010 at 2020-05-09 14:25:50
两个方面：反转录试剂可或者做定量的试剂不行了。检查一下提取的RNA样本跑一下胶，没问题的话自己再跑一下普通pcr，用actin引物试试你新反转录的cDNA，跑胶看看，啥都没有说明反转录不成功，换反转录试剂吧，如果cD ...

好的 谢谢您！今天又提了一次RNA 等下qPCR 同时还拿了别人的RNA样品 从逆转开始 再一起qPCR 看结果了 如果别人的正常 我的不正常 那就是RNA问题了。。
赞一下 回复此楼
6楼2020-05-09 19:17:59
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by owl2010 at 2020-05-09 19:36:21
为什么提取的RNA不先跑一下胶看看呢？万一降解了后续都不用做了。...

主要是不太相信是降解 我之前都这样提 别人也是这样 所以还是抱有侥幸 今天先再试一次 如果还是不好 再去跑胶吧 真降解的话 这降解的原因也蒙圈 因为枪头试剂已经全部换了
赞一下 回复此楼
8楼2020-05-09 20:57:29
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

QBLiqibing

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2020-05-11 07:59:44
若你的基因本来丰度比较低，可以考虑环境条件，你实验时周围是否还有其他操作质粒等实验
赞一下 回复此楼
9楼2020-05-10 11:32:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

渔人图图

新虫 (小有名气)
引用回帖:
9楼: Originally posted by QBLiqibing at 2020-05-10 11:32:32
若你的基因本来丰度比较低，可以考虑环境条件，你实验时周围是否还有其他操作质粒等实验

没有。今天等会跑胶，看结果吧。
赞一下 回复此楼
10楼2020-05-10 18:16:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 渔人图图 的主题更新
161/2返回列表12下一页
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[文学芳草园] 梦想 +5 myrtle 2026-08-26 8/400 2026-09-02 02:42 by Leogzhya
[基金申请] 学科评审组评审是指会评吗？ +4 瞬息宇宙 2026-08-31 4/200 2026-09-01 14:58 by jiaoxg
[基金申请] 为什么资助数各大高校都创新高，自己申请怎么就这么难 +13 Kittylucky 2026-08-27 14/700 2026-09-01 11:06 by feng6531
[基金申请] 国社科又开始会评了，不知道这次命运如何 +7 雨打竹帘 2026-08-30 11/550 2026-08-31 23:16 by hittle2008
[基金申请] 哪位高人中了，把查询到的截图贴出来让我看看，让我长长见识 +6 yuleib84 2026-08-26 7/350 2026-08-31 19:46 by 鱼翔浅底1
[基金申请] 面上意见出来了 +12 黄鸟于飞Chao 2026-08-29 23/1150 2026-08-31 18:57 by 黄鸟于飞Chao
[基金申请] 能否申诉？ +7 echo8914667 2026-08-30 8/400 2026-08-31 17:00 by yihongxu
[基金申请] 中青基了要发朋友圈吗？ +7 349506619 2026-08-28 7/350 2026-08-31 13:39 by 冼亮淀粉酶
[基金申请] 29号明天会评吗 +4 笨笨唐 2026-08-28 4/200 2026-08-31 09:30 by huixian257
[基金申请] 基金不中，共勉 +12 eulota 2026-08-26 12/600 2026-08-31 08:42 by ZJTJZ
[基金申请] 为什么到现在没收到通知？ +5 tannykie 2026-08-29 5/250 2026-08-30 21:05 by purplejack
[基金申请] 我就是申请一个面上项目而已，这评审意见是按照杰青的条件评的吧？ +6 gouxfjh 2026-08-28 11/550 2026-08-30 07:57 by gouxfjh
[基金申请] 看板上这么多中的，有点像50人群里49个人都是骗子的那种感觉…… +5 a089 2026-08-26 6/300 2026-08-27 14:05 by jonewore
[基金申请] 出来了 +9 trojank 2026-08-26 9/450 2026-08-26 14:25 by 宝贝虫子
[基金申请] 国合里面能看到了 +7 一怀馨秋 2026-08-26 7/350 2026-08-26 11:23 by zhaosm1982
[基金申请] 国际合作可查了，中了面上 (EPI+1)(金币+50) +18 Ldrop2023 2026-08-26 18/900 2026-08-26 11:15 by cmrandy
[基金申请] 系统进不去 +4 yanglien 2026-08-26 5/250 2026-08-26 11:10 by wenfengw83
[基金申请] 项目信息和经费信息在系统里都可以看到了 +6 wittyboy 2026-08-26 14/700 2026-08-26 10:55 by wittyboy
[基金申请] 国合可查了 +3 paperzjh 2026-08-26 3/150 2026-08-26 10:41 by LemmonTr
[基金申请] 牛来！米来！面来！ +8 beefly 2026-08-26 8/400 2026-08-26 08:37 by xuzhipiao
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭