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scxryu

木虫 (小有名气)

[求助] DNA解旋酶与DNA的结合检测求助已有1人参与

各位老师,我最近用DNA解旋酶与单链DNA孵育,然后用琼脂糖凝胶电泳检测,有目的条带,比单独的单链DNA(50nt大小)会大一些,在200nt的位置。
但是,紧接着用单链DNA和双链DNA的杂合体(包含50nt和20bp区域)实验,琼脂糖电泳却没有目的条带,只有跟对照组一样大小的条带,条带在80nt附近。
是解旋酶无法结合到我的ssDNA-dsDNA的杂合体上吗?
孵育缓冲液用的是:50mM HEPES pH 8, 100mM乙酸钾,1mM EDTA。暂时还没有加入ATP和Mg2+,只是检测是否能结合。
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Spring_HF
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
50bp/20bp的位置在哪里? 有没有可能单独结合了50bp的单链?

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行至水穷处,坐看云起时
2楼2020-03-03 08:34:41
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scxryu

木虫 (小有名气)

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引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2020-03-03 08:34:41
50bp/20bp的位置在哪里? 有没有可能单独结合了50bp的单链?

在80nt附近,加酶的实验组和不加酶的对照组都只有这个带。
Spring_HF
3楼2020-03-03 17:25:23
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

盐离子浓度可以降低至30,50mM,

20bp/50bp duplex有经过纯化吗,多出的单链可以让结果难以解释

20bp/50bp的话,单链30bp会是更好的对照

解旋酶是5'--->3'还是 3'--->5'?

酶的核酸除得干净吗?

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行至水穷处,坐看云起时
4楼2020-03-04 08:34:04
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scxryu

木虫 (小有名气)

送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2020-03-04 08:34:04
盐离子浓度可以降低至30,50mM,

20bp/50bp duplex有经过纯化吗,多出的单链可以让结果难以解释

20bp/50bp的话,单链30bp会是更好的对照

解旋酶是5'--->3'还是 3'--->5'?

酶的核酸除得干

酶是5'-3',里面的核酸确实是除去的,结合单链DNA的时候,也没有出现杂带。50nt-20bp的杂合体是用70nt的单链和20nt的单链退火形成的,然后做胶回收纯化的,应该没问题。我去试试把盐离子浓度降低试试,谢谢大佬。
Spring_HF
5楼2020-03-04 08:49:25
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