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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » DNA解旋酶与DNA的结合检测求助
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scxryu

木虫 (小有名气)

[求助] DNA解旋酶与DNA的结合检测求助 已有1人参与

各位老师，我最近用DNA解旋酶与单链DNA孵育，然后用琼脂糖凝胶电泳检测，有目的条带，比单独的单链DNA（50nt大小）会大一些，在200nt的位置。
但是，紧接着用单链DNA和双链DNA的杂合体（包含50nt和20bp区域）实验，琼脂糖电泳却没有目的条带，只有跟对照组一样大小的条带，条带在80nt附近。
是解旋酶无法结合到我的ssDNA-dsDNA的杂合体上吗？
孵育缓冲液用的是：50mM HEPES pH 8, 100mM乙酸钾，1mM EDTA。暂时还没有加入ATP和Mg2+，只是检测是否能结合。
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Spring_HF
1楼 2020-03-02 14:30:26
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

盐离子浓度可以降低至30，50mM,

20bp/50bp duplex有经过纯化吗，多出的单链可以让结果难以解释

20bp/50bp的话，单链30bp会是更好的对照

解旋酶是5'--->3'还是 3'--->5'？

酶的核酸除得干净吗？
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scxryu
行至水穷处，坐看云起时
4楼2020-03-04 08:34:04
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pennchem

专家顾问 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
50bp/20bp的位置在哪里？ 有没有可能单独结合了50bp的单链？
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scxryu
行至水穷处，坐看云起时
2楼2020-03-03 08:34:41
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scxryu

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by pennchem at 2020-03-03 08:34:41
50bp/20bp的位置在哪里？ 有没有可能单独结合了50bp的单链？

在80nt附近，加酶的实验组和不加酶的对照组都只有这个带。
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Spring_HF
3楼2020-03-03 17:25:23
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scxryu

木虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by pennchem at 2020-03-04 08:34:04
盐离子浓度可以降低至30，50mM,

20bp/50bp duplex有经过纯化吗，多出的单链可以让结果难以解释

20bp/50bp的话，单链30bp会是更好的对照

解旋酶是5'--->3'还是 3'--->5'？

酶的核酸除得干

酶是5'-3'，里面的核酸确实是除去的，结合单链DNA的时候，也没有出现杂带。50nt-20bp的杂合体是用70nt的单链和20nt的单链退火形成的，然后做胶回收纯化的，应该没问题。我去试试把盐离子浓度降低试试，谢谢大佬。
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Spring_HF
5楼2020-03-04 08:49:25
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