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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 目的基因连入pET-28a中，其前有His6标记，请问怎么纯化？
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wh7690703

木虫 (正式写手)

[交流] 目的基因连入pET-28a中，其前有His6标记，请问怎么纯化？

如题！
目的基因导入pET-28a中，并在大肠杆菌中获得活性表达。在目的基因前含有His6标记。请问：
A.是该采用Ni-柱来纯化吗？
B.买的话，该填料价钱大概多少？
C.哪家公司的比较好？
D.应用Ni-柱纯化目的蛋白麻烦吗？

在此等候各位大侠赐教！
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1楼 2009-06-16 20:16:25
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amisking
★ ★
wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):置顶！呵呵 6-17 09:25
顶一下！
2楼2009-06-16 20:21:22
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gusubiao

新虫 (初入文坛)
★ ★
wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢 6-17 09:24
His6标记应该用Ni-柱纯化的
我用的进口的大概千把快钱一瓶20ml
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3楼2009-06-16 21:08:58
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smurfen

至尊木虫 (著名写手)
★ ★
wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):有多快？效果如何？ 6-16 21:23
英骏的his-tag填料用得比较普遍
简单的方法就是不装柱子，在离心管里操作，挺快的呢
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Advances in Prevention of Thermal Runaway in Lithium-Ion Batteries
4楼2009-06-16 21:15:42
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chinosaur

木虫 (正式写手)

求购IQ卡
★ ★
wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢，Ni柱纯化一般就可以了吧，还需要再进一步纯化吗？ 6-17 09:21
A:是的，用镍柱纯化
B：不太清楚
C：GE的才应该是使用最广泛的，但可能比其他稍贵一点，但质量过硬
D：非常简单方便，将菌液破碎后，高速离心，将上清流过镍柱，这时你的蛋白就留在柱子上了，流过一次就足够了。如果你不放心，可以将第一次的FLOW THROUGH再流过柱子一次。然后用含5-25mM咪唑的lysis buffer去冲洗柱子两柱，洗掉杂蛋白。然后用蛋白内切酶切掉你的TAG就可以得到比较纯的蛋白了，接着就去进行下一步的纯化。镍柱的清洗用250mM的咪唑去冲洗就可以了。
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5楼2009-06-16 22:54:53
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wh7690703

木虫 (正式写手)
引用回帖:
Originally posted by chinosaur at 2009-6-16 22:54:
然后用蛋白内切酶切掉你的TAG就可以得到比较纯的蛋白了，接着就去进行下一步的纯化。

Ni柱纯化就可以了吧，还需要进一步纯化吗？

[ Last edited by wh7690703 on 2009-6-17 at 09:24 ]
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6楼2009-06-17 09:22:56
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lynn5180

铜虫 (初入文坛)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
我买的是GE的树脂5ML 570
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7楼2009-06-17 09:47:47
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hihoney

铁杆木虫 (职业作家)
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
Tags通常不会影响后来蛋白的活性，不需要切除。
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8楼2009-06-17 10:22:08
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大海一孤舟

铜虫 (小有名气)
我们用的Ni柱层析，很抱歉我不知道价格哈哈
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9楼2009-06-17 10:32:23
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haoqian6135

木虫 (正式写手)

蜗牛～
★
小木虫(金币+0.5):给个红包，谢谢回帖交流
大包装上千，具体分到每一管有50、60元，我指的是一般的镍柱。
赞一下(1人) 回复此楼
平和悦衲！
10楼2009-06-17 17:14:22
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