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wh7690703木虫 (正式写手)
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[交流]
目的基因连入pET-28a中，其前有His6标记，请问怎么纯化？
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如题！ 目的基因导入pET-28a中，并在大肠杆菌中获得活性表达。在目的基因前含有His6标记。请问： A.是该采用Ni-柱来纯化吗？ B.买的话，该填料价钱大概多少？ C.哪家公司的比较好？ D.应用Ni-柱纯化目的蛋白麻烦吗？ 在此等候各位大侠赐教！ |
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8楼2009-06-17 10:22:08
3楼2009-06-16 21:08:58
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4楼2009-06-16 21:15:42
chinosaur
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wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢，Ni柱纯化一般就可以了吧，还需要再进一步纯化吗？ 6-17 09:21
wh7690703(金币+1):谢谢参与
wh7690703(金币+1,VIP+0):谢谢，Ni柱纯化一般就可以了吧，还需要再进一步纯化吗？ 6-17 09:21
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A:是的，用镍柱纯化 B：不太清楚 C：GE的才应该是使用最广泛的，但可能比其他稍贵一点，但质量过硬 D：非常简单方便，将菌液破碎后，高速离心，将上清流过镍柱，这时你的蛋白就留在柱子上了，流过一次就足够了。如果你不放心，可以将第一次的FLOW THROUGH再流过柱子一次。然后用含5-25mM咪唑的lysis buffer去冲洗柱子两柱，洗掉杂蛋白。然后用蛋白内切酶切掉你的TAG就可以得到比较纯的蛋白了，接着就去进行下一步的纯化。镍柱的清洗用250mM的咪唑去冲洗就可以了。 |
5楼2009-06-16 22:54:53