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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于使用自杀质粒pK18SacB进行敲除受体菌基因组上的相关片段
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supergrape

金虫 (小有名气)

[求助] 关于使用自杀质粒pK18SacB进行敲除受体菌基因组上的相关片段 已有2人参与

RT，我在前期将pK18SacB进行改造，把卡那霉素基因替换为氯霉素（受体菌带有卡那霉素抗性），左右同源臂的长度大小是在500bp左右，构建好的自杀载体pK18SacB是利用大肠杆菌S17进行接合转移，将滤膜上的菌体洗脱后涂到含有卡那霉素和氯霉素的培养基上。双抗板上确实长出疑似单交换的菌株（受体菌是假单胞菌，菌落形态与大肠杆菌不一样，很容易分辨），同时涂到双抗板上的受体菌没有长。问题是，当我用左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物进行菌落PCR验证，结果只有一左同源臂+右同源臂的目的条带，没有左同源臂+敲除片段+右同源臂的目的条带（PCR延伸时间是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂的长度进行设置的）。随后，我设计了基因组上左同源臂的上游引物+自杀质粒中右同源臂下游引物进行pcr，结果没有相关目的条带（PCR延伸时间是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂+300 bp的长度进行设置的）。恳请大佬解释一下，双抗板上的菌株是单交换的菌株吗？
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1楼 2020-01-01 14:44:42
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
随机整合的单交换

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2楼2020-01-01 21:13:28
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ...
感谢参与，应助指数 +1
supergrape: 金币+100, ★有帮助 2020-01-12 20:21:20
左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物 PCR 产物送测序，如果是你设计的同源臂，那应该是成功的
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» 本帖已获得的红花（最新10朵）

supergrape
3楼2020-01-02 19:54:08
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supergrape

金虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by biosci at 2020-01-01 21:13:28
随机整合的单交换

随机整合的单交换会出现我基因组上原有的片段，即左同源臂+敲除片段+右同源臂

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4楼2020-01-02 23:05:54
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supergrape

金虫 (小有名气)
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3楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-01-02 19:54:08
左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物 PCR 产物送测序，如果是你设计的同源臂，那应该是成功的

我一共做了20个菌落PCR，结果都只有左同源臂+右同源臂的目的条带。

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5楼2020-01-02 23:09:35
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
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5楼: Originally posted by supergrape at 2020-01-02 23:09:35
我一共做了20个菌落PCR，结果都只有左同源臂+右同源臂的目的条带。
...

我觉着可以接着做双交换，我也出现过这种情况。双交换筛选出来的记得再到单交换平板验证，不能生长就对了。
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6楼2020-01-03 18:55:09
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supergrape

金虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-01-03 18:55:09
我觉着可以接着做双交换，我也出现过这种情况。双交换筛选出来的记得再到单交换平板验证，不能生长就对了。...

我把需要验证的单交换菌株点板至含有10%蔗糖的培养基中（碳源只有蔗糖），结果菌体都能在该平板上生长，而且生长速度很快。
同时，我随机挑了4个默认为单交换的菌进行无压力培养，涂10%蔗糖的固体培养基，挑了70个进行验证，结果都是野生菌。
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7楼2020-01-05 09:13:50
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
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7楼: Originally posted by supergrape at 2020-01-05 09:13:50
我把需要验证的单交换菌株点板至含有10%蔗糖的培养基中（碳源只有蔗糖），结果菌体都能在该平板上生长，而且生长速度很快。
同时，我随机挑了4个默认为单交换的菌进行无压力培养，涂10%蔗糖的固体培养基，挑了70个 ...

单交换获得的菌株我是在双抗（质粒抗性加菌株抗性）培养基中过夜培养，再涂10%蔗糖+菌株抗性固体平板。涂平板的时候根据菌的生长状态选择稀释或不稀释。如果还是不行就只能重做结合转移了。我也是重复很多次才敲下几个基因。
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8楼2020-01-05 10:26:47
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supergrape

金虫 (小有名气)
单交换的菌株不应该是在没有含质粒抗性的培养基中培养吗？

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9楼2020-01-05 19:03:19
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supergrape

金虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-01-05 10:26:47
单交换获得的菌株我是在双抗（质粒抗性加菌株抗性）培养基中过夜培养，再涂10%蔗糖+菌株抗性固体平板。涂平板的时候根据菌的生长状态选择稀释或不稀释。如果还是不行就只能重做结合转移了。我也是重复很多次才敲下 ...

为什么是在双抗培养基中过夜培养？

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10楼2020-01-06 13:59:49
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