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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 关于使用自杀质粒pK18SacB进行敲除受体菌基因组上的相关片段
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狗狗狗尾巴草

金虫 (小有名气)
引用回帖:
10楼: Originally posted by supergrape at 2020-01-06 13:59:49
为什么是在双抗培养基中过夜培养？
...

我的理解就是单交换筛选出来的菌里面，质粒和细菌共用一段核酸（左右同源臂），这个时候阳性首先得是我们的目的菌株，其次还要有质粒，所以要加双抗。（满足这种条件的除了发生同源重组的，还有质粒转进细菌的可能，这种情况下就要重新做结合转移了）。双交换的时候，蔗糖使质粒停止复制，所以最终得到的只有我们的目的菌株。
培养含有质粒的大肠都会加相应的抗生素，是一样的道理。
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supergrape
11楼2020-01-06 18:58:13
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supergrape

金虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
11楼: Originally posted by 狗狗狗尾巴草 at 2020-01-06 18:58:13
我的理解就是单交换筛选出来的菌里面，质粒和细菌共用一段核酸（左右同源臂），这个时候阳性首先得是我们的目的菌株，其次还要有质粒，所以要加双抗。（满足这种条件的除了发生同源重组的，还有质粒转进细菌的可能 ...

质粒转移到受体菌后，质粒所携带的复制子类型是大肠杆菌的，所以在受体菌中不起到复制作用，因此我觉得质粒不整合到细菌基因组上是不会双抗板上长的。
我现在把菌体在双抗培养基中培养传代，然后涂20%蔗糖板，用无抗培养基传第二代，再涂20%蔗糖板，看看能不能长。S17含自杀质粒的菌体也在做蔗糖浓度敏感测试中。

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12楼2020-01-06 19:35:14
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茶白不是白

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

你好，我最近也要做铜绿假单胞菌某一基因敲除，很多不太懂，请问可以和您交流一下吗？
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凡是过往，皆为序章
13楼2020-12-02 15:28:48
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