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关于使用自杀质粒pK18SacB进行敲除受体菌基因组上的相关片段已有2人参与
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| RT，我在前期将pK18SacB进行改造，把卡那霉素基因替换为氯霉素（受体菌带有卡那霉素抗性），左右同源臂的长度大小是在500bp左右，构建好的自杀载体pK18SacB是利用大肠杆菌S17进行接合转移，将滤膜上的菌体洗脱后涂到含有卡那霉素和氯霉素的培养基上。双抗板上确实长出疑似单交换的菌株（受体菌是假单胞菌，菌落形态与大肠杆菌不一样，很容易分辨），同时涂到双抗板上的受体菌没有长。问题是，当我用左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物进行菌落PCR验证，结果只有一左同源臂+右同源臂的目的条带，没有左同源臂+敲除片段+右同源臂的目的条带（PCR延伸时间是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂的长度进行设置的）。随后，我设计了基因组上左同源臂的上游引物+自杀质粒中右同源臂下游引物进行pcr，结果没有相关目的条带（PCR延伸时间是按照左同源臂+敲除片段+右同源臂+300 bp的长度进行设置的）。恳请大佬解释一下，双抗板上的菌株是单交换的菌株吗？ |
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13楼2020-12-02 15:28:48
2楼2020-01-01 21:13:28
【答案】应助回帖
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supergrape: 金币+100, ★有帮助 2020-01-12 20:21:20
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| 左同源臂的上游引物+右同源臂的下游引物 PCR 产物送测序，如果是你设计的同源臂，那应该是成功的 |
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supergrape3楼2020-01-02 19:54:08
4楼2020-01-02 23:05:54