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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 胶回收没有条带
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婉柳

新虫 (小有名气)

[求助] 胶回收没有条带 已有3人参与

胶回收的时候，用的是1％的琼脂糖凝胶电泳，0.2g琼脂糖，20mlTBE，用一厘米左右的梳子。上样的时候，上样量20微升，配1微升loading buffer，按试剂盒上操作的，回收后，没有条带。是不是buffer太少了，上样量了不够，浓度太低了？还有在紫外灯下切胶时间有3-4分钟，时间太长是不是也有影响？还有其他什么原因，分析不出来了，请各位老师，大神指教

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1楼 2019-12-29 18:04:36
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-12-29 22:08:36
一个孔太少了，本来胶回收率就10%左右，多上样几个孔回收就好了

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2楼2019-12-29 18:35:54
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婉柳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2019-12-29 18:35:54
一个孔太少了，本来胶回收率就10%左右，多上样几个孔回收就好了

明天试试多加几个孔。如果想省点事的话，一个空最多可以加多少量的样，把pcr产物混合均匀，加到一个孔里，可以么？另外，一个孔里加多少微升loadong buffer合适？

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3楼2019-12-29 19:26:15
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

优秀版主优秀版主
引用回帖:
3楼: Originally posted by 婉柳 at 2019-12-29 19:26:15
明天试试多加几个孔。如果想省点事的话，一个空最多可以加多少量的样，把pcr产物混合均匀，加到一个孔里，可以么？另外，一个孔里加多少微升loadong buffer合适？
...

loading buffer 按照说明书指导来，另外大孔胶可以加样50ul

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4楼2019-12-29 19:30:34
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婉柳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 渊博震天 at 2019-12-29 19:30:34
loading buffer 按照说明书指导来，另外大孔胶可以加样50ul
...

我从来没见过loading buffer的说明书，明天去好好找找。1㎝左右的孔，加样50微升的话，用多少buffer合适

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5楼2019-12-29 19:35:08
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雨独步

铁杆木虫 (著名写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2019-12-29 22:08:53
loading buffer稀释到1*就行，比如我们用的6*的，就是加五分之一的loading。1CM的孔，加50ul没问题，我们最大的孔可以加100ul。切胶时间稍微长了一点有可能导致DNA突变，但基本不会影响回收。如果切胶时条带很亮，但是最后回收浓度很低，那我怀疑你们胶回收试剂盒的W2漂洗液是不是忘加酒精了。
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6楼2019-12-29 20:08:05
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匿名

用户注销 (著名写手)
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7楼2019-12-29 20:11:14
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婉柳

新虫 (小有名气)
引用回帖:
6楼: Originally posted by 雨独步 at 2019-12-29 20:08:05
loading buffer稀释到1*就行，比如我们用的6*的，就是加五分之一的loading。1CM的孔，加50ul没问题，我们最大的孔可以加100ul。切胶时间稍微长了一点有可能导致DNA突变，但基本不会影响回收。如果切胶时条带很亮，但 ...

谢谢指点，W2是加过酒精的，我明天再试试

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8楼2019-12-29 20:18:36
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qiufeng-cs

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
我是1cm的孔，上样20ul，切胶时间一般1min之内完成，跑胶条带很清晰。buffer就稀释成一倍的就行了。切胶时间缩短点。胶回收时，EB水按最小量加。
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9楼2019-12-30 16:45:49
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