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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » Red同源重组，大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊？
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)

[交流] Red同源重组，大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊？

萌新最近开始做Red同源重组来敲除大肠杆菌O157(EDL933)中的一个基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20这三个质粒，从DH5a中提取出来就PCR验证了，证明质粒没有问题，现在已经得到了pKD46/O157重组子，下一步就是打靶片段扩增，我的打靶片段是选取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4为模板扩增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖终浓度是30mM，诱导2h，再用10%甘油处理做成电转感受态，电转条件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后离心涂布到Kan抗性平板，设置了阴性对照（电转水）、阳性对照（电转pKD4），打靶片段还用Dpn 1处理了，但是实验组和对照组都没有长。
我怀疑是这样几个原因：
1.电转感受态制备活性不够好
2.打靶片段扩增出现错配（我没有测序，是PCR产物用Dpn 1酶处理再跑胶切胶回收）
3.是不是同源替换片段太长了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，会不会是太长了同源重组难以发生？
4.我师兄说现在第一步就是把阳性对照弄出来，但是阳性对照我看了pKD4和pKD46没有相同的启动子，应该是可以共存的，那就是说明我电转化感受态制备有问题？
5.还有个问题就是我怎么判断pKD46被诱导表达了同源重组酶？
想请教下各位分子大佬，有没有做这方面的经验，能对小弟我指导下，而且网上查还说大肠杆菌K系列什么的容易敲除，这个什么系列是怎么查看的呢？
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1楼 2019-12-03 09:46:27
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
可能是打靶DNA片段浓度太低，导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度，不用DpnI处理，另外，你的电击电压太大，导致致死率偏高

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3楼2019-12-03 11:53:27
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
k12大肠菌株就是很好敲除

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8楼2019-12-03 17:27:22
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-12-03 11:53:27
可能是打靶DNA片段浓度太低，导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度，不用DpnI处理，另外，你的电击电压太大，导致致死率偏高

降低pKD4模板浓度和Dpn 1处理的目的不都是为了减少模板影响的假阳性吗？我pKD4浓度时从DH5a中提取的，没有测量具体浓度
电机电压过高，一般多少合适？
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10楼2019-12-03 19:52:30
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安静de执着14

新虫 (著名写手)
引用回帖:
10楼: Originally posted by 寒冬夜寂 at 2019-12-03 19:52:30
降低pKD4模板浓度和Dpn 1处理的目的不都是为了减少模板影响的假阳性吗？我pKD4浓度时从DH5a中提取的，没有测量具体浓度
电机电压过高，一般多少合适？...

你用DpnI处理后，有没有再纯化一下呢？如果再纯化的话，可能会降低打靶DNA的浓度。如果不纯化，可能会影响电击。你试试1.5——1.8KV。

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11楼2019-12-03 20:20:01
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
引用回帖:
9楼: Originally posted by 寒冬夜寂 at 2019-12-03 19:50:10
想请教一下这个K12是怎么查询的呢？...

k12菌株就是最常见的大肠杆菌原始株，很多其他型号菌株都是这个菌株衍生而来的，比如dh5a

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12楼2019-12-03 22:14:59
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85888888

铁虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
你好，请问你最后成功了么？我现在也在做这个，也遇到了这个问题，阳性对照也不长
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29楼2021-04-19 10:59:46
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)
引用回帖:
8楼: Originally posted by biosci at 2019-12-03 17:27:22
k12大肠菌株就是很好敲除

想请教一下这个K12是怎么查询的呢？
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9楼2019-12-03 19:50:10
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夜来猪叫声

铁虫 (小有名气)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
引用回帖:
11楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-12-03 20:20:01
你用DpnI处理后，有没有再纯化一下呢？如果再纯化的话，可能会降低打靶DNA的浓度。如果不纯化，可能会影响电击。你试试1.5——1.8KV。
...

请问你之前电转时候片段浓度是多少啊？

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18楼2020-11-14 20:04:58
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初七初七呐

新虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
请问楼主可以给个联系方式么？最近在做电转一直没敲掉目的基因。

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31楼2021-06-19 09:43:17
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85888888

铁虫 (初入文坛)
引用回帖:
31楼: Originally posted by 初七初七呐 at 2021-06-19 09:43:17
请问楼主可以给个联系方式么？最近在做电转一直没敲掉目的基因。

请问你成功了么？我也一直在做的这个，但是都没有成功
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32楼2021-12-16 13:43:11
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chenhuanlong

禁虫 (文学泰斗)
本帖内容被屏蔽
33楼2021-12-17 14:22:20
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忆江南江南好

新虫 (初入文坛)
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
我们可以代做，做不出不收费ts901128@126.com
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34楼2022-01-13 21:49:28
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忆江南江南好

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
引用回帖:
32楼: Originally posted by 85888888 at 2021-12-16 13:43:11
请问你成功了么？我也一直在做的这个，但是都没有成功...

我们可以代做，做不出不收费ts901128@126.com
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35楼2022-01-13 21:50:33
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xiaoqiuqiu202楼
2019-12-03 11:15   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
xiaoshuang14楼
2019-12-03 13:06   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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solarzhao5楼
2019-12-03 13:20   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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hikingman6楼
2019-12-03 13:31   回复  
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biosci7楼
2019-12-03 17:26   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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miaojiabing13楼
2019-12-04 08:28   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
psylhh14楼
2019-12-05 20:12   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
nono200915楼
2019-12-06 18:01   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
·
miaojiabing16楼
2019-12-09 11:39   回复  
tzynew17楼
2019-12-09 19:25   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
shehuifei19楼
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