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Red同源重组,大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊?
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![]() ![]() 萌新最近开始做Red同源重组来敲除大肠杆菌O157(EDL933)中的一个基因,我用的是pKD4 pKD46 pCP20这三个质粒,从DH5a中提取出来就PCR验证了,证明质粒没有问题,现在已经得到了pKD46/O157重组子,下一步就是打靶片段扩增,我的打靶片段是选取目的基因上下游50bp同源,然后以pKD4为模板扩增含有Kan抗性的打靶片段,L-阿拉伯糖终浓度是30mM,诱导2h,再用10%甘油处理做成电转感受态,电转条件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h,之后离心涂布到Kan抗性平板,设置了阴性对照(电转水)、阳性对照(电转pKD4),打靶片段还用Dpn 1处理了,但是实验组和对照组都没有长。我怀疑是这样几个原因: 1.电转感受态制备活性不够好 2.打靶片段扩增出现错配(我没有测序,是PCR产物用Dpn 1酶处理再跑胶切胶回收) 3.是不是同源替换片段太长了,我打靶片段是1598bp,然后目的基因是699bp,会不会是太长了同源重组难以发生? 4.我师兄说现在第一步就是把阳性对照弄出来,但是阳性对照我看了pKD4和pKD46没有相同的启动子,应该是可以共存的,那就是说明我电转化感受态制备有问题? 5.还有个问题就是我怎么判断pKD46被诱导表达了同源重组酶? 想请教下各位分子大佬,有没有做这方面的经验,能对小弟我指导下,而且网上查还说大肠杆菌K系列什么的容易敲除,这个什么系列是怎么查看的呢? ![]() |
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寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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可能是打靶DNA片段浓度太低,导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度,不用DpnI处理,另外,你的电击电压太大,导致致死率偏高 发自小木虫Android客户端 |
3楼2019-12-03 11:53:27
8楼2019-12-03 17:27:22
10楼2019-12-03 19:52:30
11楼2019-12-03 20:20:01
12楼2019-12-03 22:14:59
29楼2021-04-19 10:59:46
9楼2019-12-03 19:50:10
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32楼2021-12-16 13:43:11
chenhuanlong
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33楼2021-12-17 14:22:20
34楼2022-01-13 21:49:28
35楼2022-01-13 21:50:33
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2019-12-03 11:15
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2019-12-03 13:06
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2019-12-03 13:31
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biosci7楼
2019-12-03 17:26
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j 发自小木虫Android客户端
miaojiabing13楼
2019-12-04 08:28
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psylhh14楼
2019-12-05 20:12
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nono200915楼
2019-12-06 18:01
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miaojiabing16楼
2019-12-09 11:39
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tzynew17楼
2019-12-09 19:25
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shehuifei19楼
2020-11-14 21:19
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