| 查看: 5044 | 回复: 34 | |||
| 当前只显示满足指定条件的回帖，点击这里查看本话题的所有回帖 | |||
[交流]
Red同源重组，大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊？
|
|||
 萌新最近开始做Red同源重组来敲除大肠杆菌O157(EDL933)中的一个基因，我用的是pKD4 pKD46 pCP20这三个质粒，从DH5a中提取出来就PCR验证了，证明质粒没有问题，现在已经得到了pKD46/O157重组子，下一步就是打靶片段扩增，我的打靶片段是选取目的基因上下游50bp同源，然后以pKD4为模板扩增含有Kan抗性的打靶片段，L-阿拉伯糖终浓度是30mM，诱导2h，再用10%甘油处理做成电转感受态，电转条件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h，之后离心涂布到Kan抗性平板，设置了阴性对照（电转水）、阳性对照（电转pKD4），打靶片段还用Dpn 1处理了，但是实验组和对照组都没有长。我怀疑是这样几个原因： 1.电转感受态制备活性不够好 2.打靶片段扩增出现错配（我没有测序，是PCR产物用Dpn 1酶处理再跑胶切胶回收） 3.是不是同源替换片段太长了，我打靶片段是1598bp，然后目的基因是699bp，会不会是太长了同源重组难以发生？ 4.我师兄说现在第一步就是把阳性对照弄出来，但是阳性对照我看了pKD4和pKD46没有相同的启动子，应该是可以共存的，那就是说明我电转化感受态制备有问题？ 5.还有个问题就是我怎么判断pKD46被诱导表达了同源重组酶？ 想请教下各位分子大佬，有没有做这方面的经验，能对小弟我指导下，而且网上查还说大肠杆菌K系列什么的容易敲除，这个什么系列是怎么查看的呢？ |
回复此楼» 猜你喜欢
AM630（CAS 164178-33-0）：CB2 选择性配体的实验使用与供应要点
已经有0人回复
-
ADC标杆分子T-DM1全解析：从结构设计到实验室应用的技术要点
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有106人回复
-
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
» 抢金币啦！回帖就可以得到:
-
持续创业者，A8离异男征婚，事业遇到瓶颈，寻找生活伴侣
+1/990
-
2027年航天航空、材料与人工智能国际会议（AMAI 2027）
+1/929
-
2027年电气工程、自动化与应用工程国际会议（EEAE 2027）
+1/911
-
2027年生物医学、农业与可持续发展国际会议（BASD 2027）
+1/880
-
大连理工大学控制科学与工程学院欧勇盛教授课题组2026年科研助理招聘启事
+2/164
-
韩国全北国立大学禽病研究所博士研究生招生简章
+2/52
-
求助邢其毅第四版基础有机化学PDF版
+1/32
-
加拿大UBC博士后招聘｜人工智能 × 电池
+1/17
-
加拿大UBC博士/博士后招聘｜人工智能 × 电池
+1/16
-
【博士后招聘】大湾区大学讲席教授张伟与中国科学技术大学徐航勋教授联培博士后招聘
+1/16
-
【博士后招聘】大湾区大学讲席教授张伟与中国科学技术大学徐航勋教授联培博士后招聘
+1/15
-
大湾区大学姚瑶课题组2027届博士生招生 （与中山大学联合培养）
+1/8
-
加拿大UBC博士后招聘｜人工智能 × 电池
+1/7
-
【征稿】Springer Nature热电专题 Discover Materials / Discover Chemistry
+1/4
-
东南大学招收博士研究生
+1/4
-
东南大学招收博士研究生
+1/4
-
中山大学智能传感仪器方向招2027届考核制博士生
+1/4
-
中山大学可穿戴电路系统方向招2027届考核制博士生
+1/3
-
东南大学招收博士研究生
+1/2
-
长春工业大学车辆与交通学院韩玲教授团队招收审核制2027年秋季入学博士生
+1/1
12楼2019-12-03 22:14:59
★
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
|
可能是打靶DNA片段浓度太低，导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度，不用DpnI处理，另外，你的电击电压太大，导致致死率偏高 发自小木虫Android客户端 |
3楼2019-12-03 11:53:27
8楼2019-12-03 17:27:22
9楼2019-12-03 19:50:10
简单回复
2019-12-03 13:06
回复
2019-12-03 13:20
回复
2019-12-03 13:31
回复
biosci7楼
2019-12-03 17:26
回复
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
j 发自小木虫Android客户端