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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)


[交流] Red同源重组,大肠杆菌EDL933同源重组效率低是什么原因啊?

萌新最近开始做Red同源重组来敲除大肠杆菌O157(EDL933)中的一个基因,我用的是pKD4 pKD46 pCP20这三个质粒,从DH5a中提取出来就PCR验证了,证明质粒没有问题,现在已经得到了pKD46/O157重组子,下一步就是打靶片段扩增,我的打靶片段是选取目的基因上下游50bp同源,然后以pKD4为模板扩增含有Kan抗性的打靶片段,L-阿拉伯糖终浓度是30mM,诱导2h,再用10%甘油处理做成电转感受态,电转条件是2.5kv,5ms。加入1ml LB 30℃孵育2h,之后离心涂布到Kan抗性平板,设置了阴性对照(电转水)、阳性对照(电转pKD4),打靶片段还用Dpn 1处理了,但是实验组和对照组都没有长。
我怀疑是这样几个原因:
1.电转感受态制备活性不够好
2.打靶片段扩增出现错配(我没有测序,是PCR产物用Dpn 1酶处理再跑胶切胶回收)
3.是不是同源替换片段太长了,我打靶片段是1598bp,然后目的基因是699bp,会不会是太长了同源重组难以发生?
4.我师兄说现在第一步就是把阳性对照弄出来,但是阳性对照我看了pKD4和pKD46没有相同的启动子,应该是可以共存的,那就是说明我电转化感受态制备有问题?
5.还有个问题就是我怎么判断pKD46被诱导表达了同源重组酶?
想请教下各位分子大佬,有没有做这方面的经验,能对小弟我指导下,而且网上查还说大肠杆菌K系列什么的容易敲除,这个什么系列是怎么查看的呢?
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安静de执着14

新虫 (著名写手)



寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
可能是打靶DNA片段浓度太低,导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度,不用DpnI处理,另外,你的电击电压太大,导致致死率偏高

发自小木虫Android客户端
3楼2019-12-03 11:53:27
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)


8楼2019-12-03 17:27:22
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)


引用回帖:
8楼: Originally posted by biosci at 2019-12-03 17:27:22
k12大肠菌株就是很好敲除

想请教一下这个K12是怎么查询的呢?
9楼2019-12-03 19:50:10
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寒冬夜寂

新虫 (小有名气)


引用回帖:
3楼: Originally posted by 安静de执着14 at 2019-12-03 11:53:27
可能是打靶DNA片段浓度太低,导致重组效率低。可以降低pKD 4扩增时的模板浓度,不用DpnI处理,另外,你的电击电压太大,导致致死率偏高

降低pKD4模板浓度和Dpn 1处理的目的不都是为了减少模板影响的假阳性吗?我pKD4浓度时从DH5a中提取的,没有测量具体浓度
电机电压过高,一般多少合适?
10楼2019-12-03 19:52:30
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简单回复
2019-12-03 13:06   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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solarzhao5楼
2019-12-03 13:20   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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hikingman6楼
2019-12-03 13:31   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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biosci7楼
2019-12-03 17:26   回复  
寒冬夜寂(金币+1): 谢谢参与
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