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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 胶回收产物连t载体连不上 求教
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xydlengyue

金虫 (正式写手)

[交流] 胶回收产物连t载体连不上 求教

rt  最近用1kb左右产物胶回收连t载体一直连不上
之前胶回收用的酶是塔卡拉的Premix Taq™ (Ex Taq™ Version 2.0 plus dye) 加的有a  然后t载体用过两种 一种是天根的pgm-t 和全式金的blunt zero cloning kit 都是按照说明书来的  在氨苄的板子上都长很多 但是摇菌pcr一直都是什么结果都没有 心态有点炸了 哪位大佬指导一下啊
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1楼 2019-11-11 21:35:07
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木冰衿→_→

新虫 (正式写手)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
提过质粒没有？要不跑个质粒看看？是做的菌液pcr吗？是不是验证pcr出了问题？模板稀释了吗？

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5楼2019-11-11 22:13:25
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金刚太郎

新虫 (小有名气)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
是不是压根就没连上没有导进去，板子上长的转化子都是你之前做的大肠感觉感受态染的抗性杂菌？以前我们实验室也出现过这个问题，大家都是多大肠导质粒，各种各项的抗性，结果有次弄混了，也出现了你这样的情况。

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7楼2019-11-11 22:25:07
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woshishui916

木虫 (著名写手)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
胶回收购用的是哪家的盒子？产物浓度够吗？有没有抑制剂残留？

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11楼2019-11-12 05:32:03
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
1.全式金那个是平末端的吗？我记不得了，好像有点像平的2.长很多可能是你amp过期了吧，试试新amp

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12楼2019-11-12 08:54:54
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沉默的独角兽

金虫 (正式写手)
3.你可以切胶回收看看

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13楼2019-11-12 08:56:11
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
验证的引物用过推荐的通用引物  也用过自己设计的特异性引物 但是都没有结果
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2楼2019-11-11 21:37:20
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匿名


★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
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14楼2019-11-12 10:04:19
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 木冰衿→_→ at 2019-11-11 22:13:25
提过质粒没有？要不跑个质粒看看？是做的菌液pcr吗？是不是验证pcr出了问题？模板稀释了吗？

没提质粒 做的菌液pcr 用他给的验证性引物和我自己的特异性引物都没做出来 不知道啥问题 模板就是过夜摇的菌液
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15楼2019-11-12 11:53:03
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 金刚太郎 at 2019-11-11 22:25:07
是不是压根就没连上没有导进去，板子上长的转化子都是你之前做的大肠感觉感受态染的抗性杂菌？以前我们实验室也出现过这个问题，大家都是多大肠导质粒，各种各项的抗性，结果有次弄混了，也出现了你这样的情况。
...

感受态不是制作的 是买t载体送的
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16楼2019-11-12 11:53:52
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
11楼: Originally posted by woshishui916 at 2019-11-12 05:32:03
胶回收购用的是哪家的盒子？产物浓度够吗？有没有抑制剂残留？

胶回收试剂盒是omega的 产物浓度一个50 一个100 应该没抑制剂残留吧 我都是按照说明来的
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17楼2019-11-12 11:54:49
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
12楼: Originally posted by 沉默的独角兽 at 2019-11-12 08:54:54
1.全式金那个是平末端的吗？我记不得了，好像有点像平的2.长很多可能是你amp过期了吧，试试新amp

是平末端的  他t载体说的是连上的才能生长 连不上的没法生长 都是验证全都不对...
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18楼2019-11-12 11:57:04
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
14楼: Originally posted by HLYY at 2019-11-12 10:04:19
全式金的blunt zero cloning kit 是平端连接试剂盒，当载体与片段连接不成功时，自杀基因正确表达，包含载体的细胞无法生长。天根的试剂盒也连接不上，要考虑是否是胶回收浓度太低或者是载体和片段的摩尔比不正确。

胶回收浓度50和100  片段摩尔比开始按照1比7  然后跑了几次跑不出来 就多加了模板  还是跑不出来
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19楼2019-11-12 11:58:12
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匿名


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20楼2019-11-12 14:37:50
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木冰衿→_→

新虫 (正式写手)
引用回帖:
15楼: Originally posted by xydlengyue at 2019-11-12 11:53:03
没提质粒 做的菌液pcr 用他给的验证性引物和我自己的特异性引物都没做出来 不知道啥问题 模板就是过夜摇的菌液...

如果其他没问题的话，也很有可能是菌液pcr的问题，菌液pcr操作不好经常做不出来的。记得要模板要稀释10到100倍，最好煮沸5分钟。

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22楼2019-11-12 23:39:35
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lqbzfun

铜虫 (初入文坛)
★
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
回收前，别紫外下拍照，直接切胶，速度快点。如有可能，蓝光切胶

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23楼2019-11-13 14:34:48
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xydlengyue

金虫 (正式写手)
引用回帖:
23楼: Originally posted by lqbzfun at 2019-11-13 14:34:48
回收前，别紫外下拍照，直接切胶，速度快点。如有可能，蓝光切胶

请问这个照多久算久呢

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24楼2019-11-13 21:30:26
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tzynew3楼
2019-11-11 21:49   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
solarzhao4楼
2019-11-11 22:00   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
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xiaoshuang16楼
2019-11-11 22:21   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
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syhorchid8楼
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hikingman9楼
2019-11-12 00:21   回复  
xydlengyue(金币+1): 谢谢参与
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xiaoqiuqiu2010楼
2019-11-12 00:34   回复  
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psylhh21楼
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miaojiabing25楼
2019-11-14 08:29   回复  
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nono200926楼
2021-10-03 13:37   回复  
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刀劈三关27楼
2021-10-04 21:52   回复  
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