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江湖救急 已有2人参与
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诶，惭愧。这个PCR折磨了我一个多月了。刚开始部分能p出来，几个挑单克隆测序不对，测序出来了3个，后面再做pcr怎么p都不出来了，用什么酶都试了一遍，退火条件也试过了，都跑不出来。用基因组DNA也不行，跑出来几个，纯化后连接转化挑不出阳性。PCR卡就算了，好几个还都卡在阳性挑不出来，好郁闷啊，后面觉得是引物可能设的不好，所以重设了引物，但是也就提高了退火，降低了上下游的差异在差中选优，还是没有扩增出来。想问问有没有有经验的，想请教一下，是模板的问题吗？RNA打算重新提一下。阳性挑不出来又该怎么调整呢，用的是重组连接酶，和这个有关系吗？ 发自小木虫Android客户端 |
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2楼2019-10-30 20:53:05
3楼2019-10-30 23:05:33
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小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-10-31 22:48:05
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首先 你这是提什么的rna rna跑胶情况图有吗 引物是根据什么来设计的 推荐pcr温度多少 发自小木虫Android客户端 |
4楼2019-10-31 00:29:30
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提的水稻的RNA有两条带，第三条带看不到。是不是不太好，浓度在1300ng左右，引物是按照infusion的要求设的除了酶切位点有15个碱基的模板匹配，剩余分别基因的cds两端，推荐的退火在60℃左右 发自小木虫Android客户端 |
5楼2019-10-31 11:47:23
6楼2019-10-31 20:03:42
7楼2019-10-31 20:11:50