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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆连接后无果～ 求赐教…
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skynet999

新虫 (初入文坛)
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克隆连接后无果～ 求赐教…
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EcoRI和BglII双酶切…大片段载体大概10kb，插入片段200bp左右，T4连接一直无果， 16度过夜后放4度半天，平板有些许克隆，但都不是重组产物，目测大部分都是载体片段……… 求大牛赐教 该肿么破 已经克隆了近俩月一直这个样 …… TT

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1楼 2019-06-17 17:43:41
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ma08105

铜虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:49:25
确定下两个酶会不会有一个用错了或者坏了

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6楼2019-06-17 17:46:21
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alexlihan

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:49:14
检查一下内切酶是否过期，感受态是否失活

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13楼2019-06-17 17:58:26
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HanLL0926

新虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:48:26
增加目的片段的量试一试，相应的降低质粒载体的量；换一种连接反应体系，比如TAKALA的有一种；

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17楼2019-06-17 18:06:10
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chenpp2006

新虫 (正式写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:48:37
会不会是酶切的问题呢？如果是用NEB的bglii，酶切buffer要用3.1，而不是smart。

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skynet999
23楼2019-06-17 19:03:08
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王菲0913

新虫 (著名写手)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:48:49
感受态需要重新做，另外把载体的连接比换到1:7，再做一次

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skynet999
24楼2019-06-17 19:45:10
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skynet999

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23楼: Originally posted by chenpp2006 at 2019-06-17 19:03:08
会不会是酶切的问题呢？如果是用NEB的bglii，酶切buffer要用3.1，而不是smart。

啊… 确实我用的是smart 不过后来我单独用bglii切了一次 跑胶也显示已经切开了呀 并没有什么异常 用smart对连接反应有很大影响么？

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25楼2019-06-17 21:16:19
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skynet999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by HanLL0926 at 2019-06-17 18:06:10
增加目的片段的量试一试，相应的降低质粒载体的量；换一种连接反应体系，比如TAKALA的有一种；

我载体用的500ng 有一次片段加了1ug了 也还是没有成功… 另外，我的片段pcr产物酶切后在-20度放了得有快三个月了 不知道有没有影响呢…

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26楼2019-06-17 21:18:49
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引用回帖:
13楼: Originally posted by alexlihan at 2019-06-17 17:58:26
检查一下内切酶是否过期，感受态是否失活

内切酶切后跑胶显示已经切开了 … 感受态同组的人也一直在用 估计也是没啥问题

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27楼2019-06-17 21:20:33
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skynet999

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引用回帖:
24楼: Originally posted by 王菲0913 at 2019-06-17 19:45:10
感受态需要重新做，另外把载体的连接比换到1:7，再做一次

之前放的插入片段的比例比1:7还要大的多 也没有成功… 难道是加太多了插入片段也不行么？

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28楼2019-06-17 21:22:43
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lcn5202楼
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ma081053楼
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hdchina20104楼
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tzynew5楼
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立林25836910楼
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大大大蒙11楼
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alexlihan12楼
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wxiaona14楼
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nadp16316楼
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wangli520818楼
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