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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 克隆连接后无果～ 求赐教…
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skynet999

新虫 (初入文坛)
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克隆连接后无果～ 求赐教…
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EcoRI和BglII双酶切…大片段载体大概10kb，插入片段200bp左右，T4连接一直无果， 16度过夜后放4度半天，平板有些许克隆，但都不是重组产物，目测大部分都是载体片段……… 求大牛赐教 该肿么破 已经克隆了近俩月一直这个样 …… TT

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1楼2019-06-17 17:43:41
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skynet999

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
17楼: Originally posted by HanLL0926 at 2019-06-17 18:06:10
增加目的片段的量试一试，相应的降低质粒载体的量；换一种连接反应体系，比如TAKALA的有一种；

我载体用的500ng 有一次片段加了1ug了 也还是没有成功… 另外，我的片段pcr产物酶切后在-20度放了得有快三个月了 不知道有没有影响呢…

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26楼2019-06-17 21:18:49
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ma08105

铜虫 (著名写手)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:49:25
确定下两个酶会不会有一个用错了或者坏了

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6楼2019-06-17 17:46:21
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alexlihan

铁杆木虫 (正式写手)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-06-17 21:49:14
检查一下内切酶是否过期，感受态是否失活

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13楼2019-06-17 17:58:26
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lcn5202楼
2019-06-17 17:44   回复  
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ma081053楼
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hdchina20104楼
2019-06-17 17:44   回复  
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tzynew5楼
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流水江南7楼
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124648楼
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秋土豆香9楼
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立林25836910楼
2019-06-17 17:56   回复  
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大大大蒙11楼
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alexlihan12楼
2019-06-17 17:56   回复  
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wxiaona14楼
2019-06-17 17:58   回复  
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