24小时热门版块排行榜    

CyRhmU.jpeg
查看: 1361  |  回复: 9

树影_色彩

新虫 (正式写手)

[求助] 长DNA片段扩增问题已有1人参与

大神有没有对于PCR扩增长DNA片段的建议?
最近在扩一个基因,设计引物分成了3段在扩增。
用的是takara公司的prime star GXL酶,尝试了TKS酶, 也换了不同来源的人cDNA. (主要也在尝试看在哪里表达有和表达量高)
但是片段1要么扩增大小不对,送测序测不出来,要么扩增不出来
片段2一直是扩增出来两条带,测序说是杂带
片段3一直未扩增出来

发自小木虫Android客户端
回复此楼
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

Misterboy

铁虫 (正式写手)

重新设计引物吧,我最近也P不出来,试了几个酶,也不行,我觉的还是引物的事

发自小木虫IOS客户端
2楼2019-04-14 23:29:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kyuwook12

新虫 (正式写手)

多长 我试过12kb 用的cloneHIFI酶

发自小木虫IOS客户端
3楼2019-04-14 23:31:15
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

树影_色彩

新虫 (正式写手)

片段1 3kb. 片段2 2kb. 片段3 1kb.

发自小木虫Android客户端
4楼2019-04-14 23:33:44
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

树影_色彩

新虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by kyuwook12 at 2019-04-14 23:31:15
多长 我试过12kb 用的cloneHIFI酶

都小于3.3kb

发自小木虫Android客户端
5楼2019-04-14 23:35:05
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

树影_色彩

新虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by Misterboy at 2019-04-14 23:29:58
重新设计引物吧,我最近也P不出来,试了几个酶,也不行,我觉的还是引物的事

好吧 多谢

发自小木虫Android客户端
6楼2019-04-14 23:35:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)

我用kod neo plus 扩出来过水稻7K的基因组DNA,模版DNA要精细,高质量的

发自小木虫IOS客户端
竹杖芒鞋轻胜马,谁怕,一蓑烟雨任平生;回首向来萧瑟处,归去,也无风雨也无晴
7楼2019-04-15 00:58:22
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

kyuwook12

新虫 (正式写手)

引用回帖:
5楼: Originally posted by 树影_色彩 at 2019-04-14 23:35:05
都小于3.3kb
...

那一般的gotaq酶就可以 一对引物就行了 不需要多段的

发自小木虫IOS客户端
8楼2019-04-15 01:41:52
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yipobing

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议可以先用500bp内的小片段先测试模版质量,然后因为是cDNA作模版,循环数可以上到38到40. 可以尝试稀释pcr 产物100倍左右以稀释产物作模版,二次pcr. 然后酶的话可以用fastpfu这种扩增长片段比较好,保真性也高
9楼2019-04-16 11:52:40
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

树影_色彩

新虫 (正式写手)

引用回帖:
9楼: Originally posted by yipobing at 2019-04-16 11:52:40
建议可以先用500bp内的小片段先测试模版质量,然后因为是cDNA作模版,循环数可以上到38到40. 可以尝试稀释pcr 产物100倍左右以稀释产物作模版,二次pcr. 然后酶的话可以用fastpfu这种扩增长片段比较好,保真性也高

多谢

发自小木虫Android客户端
10楼2019-04-16 13:19:51
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 树影_色彩 的主题更新
信息提示
请填处理意见