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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » PCR相关 » 长DNA片段扩增问题
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树影_色彩

新虫 (正式写手)

[求助] 长DNA片段扩增问题 已有1人参与

大神有没有对于PCR扩增长DNA片段的建议？
最近在扩一个基因，设计引物分成了3段在扩增。
用的是takara公司的prime star GXL酶，尝试了TKS酶， 也换了不同来源的人cDNA. （主要也在尝试看在哪里表达有和表达量高）
但是片段1要么扩增大小不对，送测序测不出来，要么扩增不出来
片段2一直是扩增出来两条带，测序说是杂带
片段3一直未扩增出来

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1楼 2019-04-14 23:24:45
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Misterboy

铁虫 (正式写手)
重新设计引物吧，我最近也P不出来，试了几个酶，也不行，我觉的还是引物的事

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2楼2019-04-14 23:29:58
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kyuwook12

新虫 (正式写手)
多长 我试过12kb 用的cloneHIFI酶

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3楼2019-04-14 23:31:15
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树影_色彩

新虫 (正式写手)
片段1 3kb. 片段2 2kb. 片段3 1kb.

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4楼2019-04-14 23:33:44
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树影_色彩

新虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by kyuwook12 at 2019-04-14 23:31:15
多长 我试过12kb 用的cloneHIFI酶

都小于3.3kb

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5楼2019-04-14 23:35:05
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树影_色彩

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by Misterboy at 2019-04-14 23:29:58
重新设计引物吧，我最近也P不出来，试了几个酶，也不行，我觉的还是引物的事

好吧 多谢

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6楼2019-04-14 23:35:55
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MAS_rice

至尊木虫 (著名写手)
我用kod neo plus 扩出来过水稻7K的基因组DNA，模版DNA要精细，高质量的

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竹杖芒鞋轻胜马，谁怕，一蓑烟雨任平生；回首向来萧瑟处，归去，也无风雨也无晴
7楼2019-04-15 00:58:22
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kyuwook12

新虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 树影_色彩 at 2019-04-14 23:35:05
都小于3.3kb
...

那一般的gotaq酶就可以 一对引物就行了 不需要多段的

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8楼2019-04-15 01:41:52
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yipobing

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
建议可以先用500bp内的小片段先测试模版质量，然后因为是cDNA作模版，循环数可以上到38到40. 可以尝试稀释pcr 产物100倍左右以稀释产物作模版，二次pcr. 然后酶的话可以用fastpfu这种扩增长片段比较好，保真性也高
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9楼2019-04-16 11:52:40
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树影_色彩

新虫 (正式写手)
引用回帖:
9楼: Originally posted by yipobing at 2019-04-16 11:52:40
建议可以先用500bp内的小片段先测试模版质量，然后因为是cDNA作模版，循环数可以上到38到40. 可以尝试稀释pcr 产物100倍左右以稀释产物作模版，二次pcr. 然后酶的话可以用fastpfu这种扩增长片段比较好，保真性也高

多谢

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10楼2019-04-16 13:19:51
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