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树影_色彩

新虫 (正式写手)

[求助] 长DNA片段扩增问题 已有1人参与

大神有没有对于PCR扩增长DNA片段的建议?
最近在扩一个基因,设计引物分成了3段在扩增。
用的是takara公司的prime star GXL酶,尝试了TKS酶, 也换了不同来源的人cDNA. (主要也在尝试看在哪里表达有和表达量高)
但是片段1要么扩增大小不对,送测序测不出来,要么扩增不出来
片段2一直是扩增出来两条带,测序说是杂带
片段3一直未扩增出来

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yipobing

新虫 (小有名气)

【答案】应助回帖

感谢参与,应助指数 +1
建议可以先用500bp内的小片段先测试模版质量,然后因为是cDNA作模版,循环数可以上到38到40. 可以尝试稀释pcr 产物100倍左右以稀释产物作模版,二次pcr. 然后酶的话可以用fastpfu这种扩增长片段比较好,保真性也高
9楼2019-04-16 11:52:40
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Misterboy

铁虫 (正式写手)

重新设计引物吧,我最近也P不出来,试了几个酶,也不行,我觉的还是引物的事

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2楼2019-04-14 23:29:58
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kyuwook12

新虫 (正式写手)

多长 我试过12kb 用的cloneHIFI酶

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3楼2019-04-14 23:31:15
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树影_色彩

新虫 (正式写手)

片段1 3kb. 片段2 2kb. 片段3 1kb.

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4楼2019-04-14 23:33:44
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