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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » 请问有用过pPICZA这个质粒的嘛？
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青青宁呢

新虫 (初入文坛)

[求助] 请问有用过pPICZA这个质粒的嘛？ 已有2人参与

请问有用过pPICZA这个质粒的嘛？大家做双酶切线性化的时候用的什么酶？以及测序用的引物是什么呢？有关于这个质粒的很多问题想咨询一下。

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1楼 2019-03-02 12:52:07
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渊博震天

版主 (职业作家)

Yeast Display

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【答案】应助回帖

★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2019-03-02 16:13:15
线性化用的单酶切来的，有三个酶切位点可供选择，分别是SacI, PmeI，BstI；5' 测序引物及序列:        5′ AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′
3' 测序引物及序列:        3′ AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′
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2楼2019-03-02 14:37:38
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biosci

捐助贵宾 (知名作家)
有说明书说的很详细，看不明白可以再来问我

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3楼2019-03-04 22:41:08
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青青宁呢

新虫 (初入文坛)
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2楼: Originally posted by 渊博震天 at 2019-03-02 14:37:38
线性化用的单酶切来的，有三个酶切位点可供选择，分别是SacI, PmeI，BstI；5' 测序引物及序列:        5′ AOX1:5′-GACTGGTTCCAATTGACAAGC-3′
3' 测序引物及序列:        3′ AOX1:5′-GCAAATGGCATTCTGACATCC-3′

我用的是Kpn1和Apa1进行的双酶切，但是后面连接转化后不长菌。有人说，双酶切的位点距离小于50bp，酶切很容易不成功或者是单酶切。

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4楼2019-03-06 18:08:59
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青青宁呢

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2019-03-04 22:41:08
有说明书说的很详细，看不明白可以再来问我

我用的是Kpn1和Apa1进行的双酶切，但是后面连接转化后不长菌。有人说，双酶切的位点距离小于50bp，酶切很容易不成功或者是单酶切。我现在不知道自己的问题到底出在哪里

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5楼2019-03-06 18:09:38
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werq63

金虫 (著名写手)
不长菌说明酶切成功了，切不开或者单切会长很多的

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6楼2019-03-06 19:44:11
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werq63

金虫 (著名写手)
看看是不是插入片段的问题

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7楼2019-03-06 19:44:26
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青青宁呢

新虫 (初入文坛)
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6楼: Originally posted by werq63 at 2019-03-06 19:44:11
不长菌说明酶切成功了，切不开或者单切会长很多的

插入片段我连接到pmd18载体中测序了，没有问题。如果没切开的话应该会长，如果是单酶切呢？

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8楼2019-03-06 20:46:45
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werq63

金虫 (著名写手)
单切自连很好连的

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9楼2019-03-06 22:07:39
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青青宁呢

新虫 (初入文坛)
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9楼: Originally posted by werq63 at 2019-03-06 22:07:39
单切自连很好连的

那你觉得还可能是哪里出现问题呢？我做了快半个月了。就是连不上。谢谢谢谢

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10楼2019-03-06 22:47:00
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