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pulldown实验样品无法洗脱，阴性对照也呈阳性
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大家好， 最近在做pulldown实验，用的是talon resin，可是发现不管是his的蛋白还是没有his的蛋白都会和树脂结合，并且很难洗脱下来（20ul 1m咪唑洗脱，洗下来很少，树脂上还留有很多，猜测应该是非特异性结合），我直接用树脂和sdspage buffer煮沸跑胶，结果不管是实验组还是阴性对照组都有两个条带，这里想问一下什么原因导致蛋白无法洗脱，1，到白粘在树脂上了，2，每次wash的时候总会有一点buffer和树脂在一起不能全部去干净。下面是大致的实验步骤， 1.准备好10ul resin用loading buffer 洗3次， 2，上样，50ug his蛋白与树脂混合1h， 3.300ul washing buffer 洗3次，13000rpm 2min,每次去除上清，到树脂与上清和界面处，为了不损失树脂，剩余还有一些溶液. 4.上样，50ug unhis tagged蛋白 与树脂混合30min, 5,同步骤3. 6，剩余15ul buffer，加5ul 4x sds loading buffer 沸水浴3min， 7. sds page， 8.不管是实验组还是阴性对照都有两个条带， |
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2楼2023-05-13 22:14:46