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目标蛋白82kDa纯化出来只有25kDa?已有5人参与
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大家好，我最近让其它学校帮忙构建了一个表达我想要的蛋白的质粒，该质粒先前就带有6Histag-MBP融合蛋白，然后我的蛋白序列是直接插入在MBP之后的，他们构建完后有发给我测序报告，序列正确，我也把质粒序列放在EXPASY-translate tool上测过读码框正确是我想要的 （6Histag-MBP-我的蛋白 = 82kDa）。可纯化完后只有一条很深的25kDa的条带，我想不通，6Histag-MBP的分子量是42kDa，也就是说把MBP融合蛋白中间切断的大小。 前几步洗镍柱没有25kDa这个条带，wash buffer最高用到40mM imidazole，最后elute蛋白的时候用了500mM imidazole才出现这个25kDa的条带，那也就是说它应该是带有不少histidine的，否则自然界带Histidine很少的蛋白早就被洗下来了，基于此点我觉得读码框移位的可能性不大。想来想去裂解的时候用的是tip sonicator，虽然我中间有让E.coli冷却一下再继续，会不会还是因为power太高把蛋白降解了呢？我加了PMSF,冰上超声的。另外，跑SDSPAGE的时候，用的sample buffer里含有巯基乙醇，这个会影响吗？难道会切断MBP融合蛋白？如果是降解了，估计是断裂成很多片段了，因为前几步洗柱没有看到很显眼的某个条带。 请教各位有经验的大神，一般遇到这种情况，你们碰到的最大的可能性是什么？是蛋白讲解，还是说最后纯化出来的25kD的条带根本就是个杂蛋白？只听说过融合蛋白和目标蛋白中间断裂的，没见过融合蛋白自己中间断裂的 |
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过会不会蛋白没表达？空载的大小在蛋白胶上有一定偏差？楼主裂解菌体后有没有制样跑胶 发自小木虫Android客户端 |
2楼2018-12-21 06:58:38
3楼2018-12-22 06:38:46
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yubeihong
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8楼2018-12-27 10:35:40
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可能是杂蛋白吧，没有表达的可能性比较大，建议先确认是否表达吧; MBP tag为什么不用Amylose beads纯化？那个比Ni柱干净。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2018-12-27 11:01:27