| 查看: 2693 | 回复: 8 | |||
[交流]
目标蛋白82kDa纯化出来只有25kDa? 已有5人参与
|
|
大家好，我最近让其它学校帮忙构建了一个表达我想要的蛋白的质粒，该质粒先前就带有6Histag-MBP融合蛋白，然后我的蛋白序列是直接插入在MBP之后的，他们构建完后有发给我测序报告，序列正确，我也把质粒序列放在EXPASY-translate tool上测过读码框正确是我想要的 （6Histag-MBP-我的蛋白 = 82kDa）。可纯化完后只有一条很深的25kDa的条带，我想不通，6Histag-MBP的分子量是42kDa，也就是说把MBP融合蛋白中间切断的大小。 前几步洗镍柱没有25kDa这个条带，wash buffer最高用到40mM imidazole，最后elute蛋白的时候用了500mM imidazole才出现这个25kDa的条带，那也就是说它应该是带有不少histidine的，否则自然界带Histidine很少的蛋白早就被洗下来了，基于此点我觉得读码框移位的可能性不大。想来想去裂解的时候用的是tip sonicator，虽然我中间有让E.coli冷却一下再继续，会不会还是因为power太高把蛋白降解了呢？我加了PMSF,冰上超声的。另外，跑SDSPAGE的时候，用的sample buffer里含有巯基乙醇，这个会影响吗？难道会切断MBP融合蛋白？如果是降解了，估计是断裂成很多片段了，因为前几步洗柱没有看到很显眼的某个条带。 请教各位有经验的大神，一般遇到这种情况，你们碰到的最大的可能性是什么？是蛋白讲解，还是说最后纯化出来的25kD的条带根本就是个杂蛋白？只听说过融合蛋白和目标蛋白中间断裂的，没见过融合蛋白自己中间断裂的 |
回复此楼» 猜你喜欢
HILIC磁珠研究蛋白组学怎么做？
已经有0人回复
-
His标签蛋白纯化怎么才能快？
已经有0人回复
-
化学工程及工业化学论文润色/翻译怎么收费?
已经有128人回复
-
WRN变构抑制剂HRO761：从D1/D2界面锁定到MSI合成致死的工具化合物深度解析
已经有0人回复
-
KRAS G12V(ON) 选择性抑制剂 RMC-5127：从三元复合物机制到科研应用
已经有0人回复
-
SHP2 变构抑制剂 Sitneprotafib：从作用机制到科研试剂选型要点
已经有0人回复
-
PRMT5·MTA 抑制剂 MRTX1719 的科研应用
已经有0人回复
-
SW033291 科研使用解析：分子特征、储存与实验获取要点
已经有0人回复
-
泛 RAS 抑制新思路：大环肽拟似物如何同时牵住突变型与野生型 RAS？
已经有0人回复
-
TYK2/JAK1 双靶点工具化合物 Brepocitinib：激酶选择性、研究进展与实验应用全解析
已经有0人回复
-
矢车菊素-3-O-葡萄糖苷质控实录：从一张HPLC图谱读懂纯度与稳定性
已经有0人回复
» 本主题相关商家推荐: (我也要在这里推广)
★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-12-24 12:49:01
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-12-24 12:49:01
|
过会不会蛋白没表达？空载的大小在蛋白胶上有一定偏差？楼主裂解菌体后有没有制样跑胶 发自小木虫Android客户端 |
2楼2018-12-21 06:58:38
3楼2018-12-22 06:38:46
4楼2018-12-22 06:47:35
yubeihong
铁杆木虫 (职业作家)
- 应助: 20 (小学生)
- 金币: 7542.8
- 散金: 605
- 红花: 40
- 帖子: 3057
- 在线: 641.1小时
- 虫号: 253258
- 注册: 2006-05-20
- 性别: GG
- 专业: 生物化工与食品化工
5楼2018-12-26 20:29:07
6楼2018-12-26 23:12:35
7楼2018-12-27 02:35:15
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
本帖内容被屏蔽 |
8楼2018-12-27 10:35:40
applefav
新虫 (著名写手)
- 应助: 0 (幼儿园)
- 金币: 2051.9
- 红花: 8
- 沙发: 6
- 帖子: 1196
- 在线: 360.3小时
- 虫号: 8290308
- 注册: 2018-03-16
- 专业: 免疫生物学
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
|
可能是杂蛋白吧，没有表达的可能性比较大，建议先确认是否表达吧; MBP tag为什么不用Amylose beads纯化？那个比Ni柱干净。 发自小木虫Android客户端 |
9楼2018-12-27 11:01:27
