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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

[交流] 求助关于基因全长

请教各位高手,我现在得到一段400bp左右的片段,请问怎么样才能得到基因全长呢?如果拿不到全长基因,这段片段往下还能做些什么呢?我是绝对新手,请多帮忙!
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小猫三两只

金虫 (正式写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢,欢迎常来生物版~ 4-20 12:39
电子克隆,RACE,这方面的网上查一下就会有很多.

若得不到全长,要看你这段基因是不是完整的ORF了,否则就不会有功能,也就没法往下做了
2楼2009-04-17 10:30:54
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by 小猫三两只 at 2009-4-17 10:30:
电子克隆,RACE,这方面的网上查一下就会有很多.

若得不到全长,要看你这段基因是不是完整的ORF了,否则就不会有功能,也就没法往下做了

恩,多谢多谢!
3楼2009-04-17 11:05:39
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gastrodia

金虫 (正式写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢,欢迎常来生物版~ 4-20 12:39
先把片段放ESTscan上面,扫描一下,看看方向性,是否基因全长,或者NCBIblast与相近物种基因进行比较,推断一下,找一下阅读框,能否翻译出完整蛋白质,
不是全长的话,依据他设计引物,去3‘和5’race,race完去除引物序列,BLast检验扩出的是否目的片段,如果是拼接(dnaSTAR ASSEMBLE),拼完后找出阅读框,在阅读框2端设计引物,RTPCR扩出完整CDS,或者在基因组上walking

这段序列还可以作为探针,去掉CDNA文库或者DNA文库,筛出基因的全长

[ Last edited by gastrodia on 2009-4-17 at 11:44 ]
4楼2009-04-17 11:43:35
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-4-17 11:43:
先把片段放ESTscan上面,扫描一下,看看方向性,是否基因全长,或者NCBIblast与相近物种基因进行比较,推断一下,找一下阅读框,能否翻译出完整蛋白质,
不是全长的话,依据他设计引物,去3‘和5’race,race完去 ...

哦,多谢多谢,请问需要多长时间啊?一个月是不是时间有点紧?
5楼2009-04-17 15:10:28
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message

铁虫 (初入文坛)

估计一个月做完3‘和5’race有点紧,如果运气好的话差不多
6楼2009-04-17 18:35:46
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by message at 2009-4-17 18:35:
估计一个月做完3‘和5’race有点紧,如果运气好的话差不多

恩,多谢多谢。请问大概需要多少钱呢?
7楼2009-04-18 19:34:09
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gastrodia

金虫 (正式写手)

一个月差不多,RACE试剂盒要8000,加上PCR(配合RACE)的一共大概10000-12000,clontech的,我现在就是用这个,试剂盒的效果不错,我已经搞到3歌目的基因了,时间一个半月,生工的测序老是出问题,不然可能会更快一点
8楼2009-04-19 19:17:43
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-4-19 19:17:
一个月差不多,RACE试剂盒要8000,加上PCR(配合RACE)的一共大概10000-12000,clontech的,我现在就是用这个,试剂盒的效果不错,我已经搞到3歌目的基因了,时间一个半月,生工的测序老是出问题,不然可能会更快 ...

哦,多谢多谢啊!真的太有帮助了!
再请问一下,你拉完全长之后还想做些什么呢?如果我想做定量或是半定量的话,是不是没有全长也能做呢?我是在想,分子这部分,如果我只拉到一条全长基因的话,前面加上6-7章生理生化部分的实验,博士论文的内容会不会单薄了些?基因这部分是不是还得多做点?多谢多谢!!!
9楼2009-04-20 10:32:13
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gastrodia

金虫 (正式写手)


lwf991229(金币+1,VIP+0):辛苦辛苦~ 4-20 12:39
如果只是做RNA水平上的表达,定量和半定量的实验,没有全长也是可以做的,只要确定这段序列确实是你目的基因的片段,通过Blast就可以实现,根据这段序列设计特异性引物,去做RTPCR,如果得到的片段测序结果与你这段序列吻合的话,且又是单一条带,这个引物就可以去做RealtimePCR,或者使用这对引物合成半定量Northen杂交的探针,进行Northern BLot。
拿到全长的话,就要做蛋白质水平上的表达,来确定基因的功能,否则你得到的只是序列,并不代表它有功能,可以通过在模式生物中如酵母过表达你的序列,分析重组蛋白来确定,这方面已经有试剂盒了。
至于博士论文的内容单薄与否,不在乎内容多少,而在乎你有没有解决阶段性的科学问题,能否达到你们学校的文章上的要求,像我这里博士毕业要求一篇SCI,一篇核心,不要求影响因子,你发两篇nature也是毕不了业的,呵呵,
10楼2009-04-20 10:58:40
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