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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 求助关于基因全长
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)

[交流] 求助关于基因全长

请教各位高手，我现在得到一段400bp左右的片段，请问怎么样才能得到基因全长呢？如果拿不到全长基因，这段片段往下还能做些什么呢？我是绝对新手，请多帮忙！
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1楼 2009-04-17 09:41:58
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小猫三两只

金虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢，欢迎常来生物版~ 4-20 12:39
电子克隆,RACE,这方面的网上查一下就会有很多.

若得不到全长,要看你这段基因是不是完整的ORF了,否则就不会有功能,也就没法往下做了
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2楼2009-04-17 10:30:54
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by 小猫三两只 at 2009-4-17 10:30:
电子克隆,RACE,这方面的网上查一下就会有很多.

若得不到全长,要看你这段基因是不是完整的ORF了,否则就不会有功能,也就没法往下做了

恩，多谢多谢！
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3楼2009-04-17 11:05:39
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):感谢，欢迎常来生物版~ 4-20 12:39
先把片段放ESTscan上面，扫描一下，看看方向性，是否基因全长，或者NCBIblast与相近物种基因进行比较，推断一下，找一下阅读框，能否翻译出完整蛋白质，
不是全长的话，依据他设计引物，去3‘和5’race，race完去除引物序列，BLast检验扩出的是否目的片段，如果是拼接(dnaSTAR ASSEMBLE),拼完后找出阅读框，在阅读框2端设计引物，RTPCR扩出完整CDS，或者在基因组上walking

这段序列还可以作为探针，去掉CDNA文库或者DNA文库，筛出基因的全长

[ Last edited by gastrodia on 2009-4-17 at 11:44 ]
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4楼2009-04-17 11:43:35
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-4-17 11:43:
先把片段放ESTscan上面，扫描一下，看看方向性，是否基因全长，或者NCBIblast与相近物种基因进行比较，推断一下，找一下阅读框，能否翻译出完整蛋白质，
不是全长的话，依据他设计引物，去3‘和5’race，race完去 ...

哦，多谢多谢，请问需要多长时间啊？一个月是不是时间有点紧？
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5楼2009-04-17 15:10:28
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message

铁虫 (初入文坛)
估计一个月做完3‘和5’race有点紧，如果运气好的话差不多
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6楼2009-04-17 18:35:46
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by message at 2009-4-17 18:35:
估计一个月做完3‘和5’race有点紧，如果运气好的话差不多

恩，多谢多谢。请问大概需要多少钱呢？
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7楼2009-04-18 19:34:09
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gastrodia

金虫 (正式写手)
一个月差不多，RACE试剂盒要8000，加上PCR（配合RACE）的一共大概10000-12000，clontech的，我现在就是用这个，试剂盒的效果不错，我已经搞到3歌目的基因了，时间一个半月，生工的测序老是出问题，不然可能会更快一点
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8楼2009-04-19 19:17:43
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zhaoyue_82

铁虫 (小有名气)
引用回帖:
Originally posted by gastrodia at 2009-4-19 19:17:
一个月差不多，RACE试剂盒要8000，加上PCR（配合RACE）的一共大概10000-12000，clontech的，我现在就是用这个，试剂盒的效果不错，我已经搞到3歌目的基因了，时间一个半月，生工的测序老是出问题，不然可能会更快 ...

哦，多谢多谢啊！真的太有帮助了！
再请问一下，你拉完全长之后还想做些什么呢？如果我想做定量或是半定量的话，是不是没有全长也能做呢？我是在想，分子这部分，如果我只拉到一条全长基因的话，前面加上6-7章生理生化部分的实验，博士论文的内容会不会单薄了些？基因这部分是不是还得多做点？多谢多谢！！！
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9楼2009-04-20 10:32:13
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gastrodia

金虫 (正式写手)
★
lwf991229(金币+1,VIP+0):辛苦辛苦~ 4-20 12:39
如果只是做RNA水平上的表达，定量和半定量的实验，没有全长也是可以做的，只要确定这段序列确实是你目的基因的片段，通过Blast就可以实现，根据这段序列设计特异性引物，去做RTPCR，如果得到的片段测序结果与你这段序列吻合的话，且又是单一条带，这个引物就可以去做RealtimePCR，或者使用这对引物合成半定量Northen杂交的探针，进行Northern BLot。
拿到全长的话，就要做蛋白质水平上的表达，来确定基因的功能，否则你得到的只是序列，并不代表它有功能，可以通过在模式生物中如酵母过表达你的序列，分析重组蛋白来确定，这方面已经有试剂盒了。
至于博士论文的内容单薄与否，不在乎内容多少，而在乎你有没有解决阶段性的科学问题，能否达到你们学校的文章上的要求，像我这里博士毕业要求一篇SCI，一篇核心，不要求影响因子，你发两篇nature也是毕不了业的，呵呵，
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10楼2009-04-20 10:58:40
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