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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 抗体/Elisa » COIP实验求教
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)

[求助] COIP实验求教 已有1人参与

做两个蛋白在体内互作co-IP实验，A能拉下B，但B拉不下A，是怎么回事呢？

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1楼 2018-11-02 17:14:49
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梅雪芳

新虫 (小有名气)
同样在做COIP，个人认为你只要一个方向拉下来就行了吧？反方向会不会是因为B所结合的其他蛋白成分比较多，掩盖了A成分？

我们这边想做某个杂蛋白ESP与细胞中的蛋白DNMT/TET的相互作用，想知道这个杂蛋白ESP中的哪些成分能与细胞中的蛋白DNMT/TET相互作用，用COIP-MS的方法。
      目前的做法是，做了杂蛋白ESP的多克隆抗体（兔IgG），买了蛋白DNMT/TET的商品化抗体。将杂蛋白ESP与细胞作用48h后，做coip。洗脱后，用杂蛋白ESP的多克隆抗体做WB验证，发现没有特异性条带，也就是没拉下来，但是其他的实验又间接证明他们之间应该有关系。
   
请问这种情况会是什么问题呢？原代细胞？杂蛋白多抗的问题？蛋白与细胞作用时间太长了？
    还是说根本就没有结合？
    这种情况有没有什么解决方案，或者应该用什么方法验证一下呢？
    以下是两次COIP的结果，没有看到特异性条带
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3楼2018-11-19 22:57:38
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weizhi111

至尊木虫 (正式写手)
自己顶一个

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2楼2018-11-05 07:57:37
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幽幽深谷竹

金虫 (著名写手)

骨子里是文科男的理科男

【答案】应助回帖

★ ★ ★ ★ ★ ★ ★ ★
weizhi111: 金币+8, ★★★很有帮助 2018-12-13 08:34:49
这个其实很常见的。最好的结果是互相都能拉下来。然而实际情况是正调可以，反调不行。这可能是因为两个蛋白表达丰度不同，导致拉下来蛋白的能力不同。建议最好做过表达后的COIP，或者COip之后打质谱做分析，这样更准确
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我就是我IamwhatIam
4楼2018-12-12 22:05:13
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prthefu

木虫 (著名写手)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 幽幽深谷竹 at 2018-12-12 22:05:13
这个其实很常见的。最好的结果是互相都能拉下来。然而实际情况是正调可以，反调不行。这可能是因为两个蛋白表达丰度不同，导致拉下来蛋白的能力不同。建议最好做过表达后的COIP，或者COip之后打质谱做分析，这样更准 ...

想问一下，如果要拉下来的蛋白是未知的，那打质谱后，怎么分析是哪个蛋白呢？质谱结果分析，是不是挺难得啊，后面我也要做coip，检测的是未知蛋白。
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nothing is impossible in this world，if you have the will to win，you can achieve anything
5楼2019-01-03 11:21:58
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