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芥末本绿

金虫 (正式写手)

[交流] 基因双酶切 已有5人参与

PCR得到目的基因,胶回收后进行双酶切反应。30ul酶切体系。
1.胶回收后的浓度跑胶后应该有100ng/ul,双酶切的时候会不会浓度太高切不动?
2.EcoR 1酶切0.5h后就会产生星号活性,我们一般都是过夜切,双酶切以后基因出现多条带,有没有什么办法改进?

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ttrying

新虫 (小有名气)

★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-12 08:58:30
检查基因内部是否有相应酶切位点,常用内切酶一般不会把基因切碎的。

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2楼2018-08-11 20:18:33
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厚德求是

木虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.

★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-12 08:58:48
PCR产物纯化后跑一下胶,看看是不是引物浓度高了,p出了非特异性条带。

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3楼2018-08-11 22:16:59
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芥末本绿

金虫 (正式写手)

引用回帖:
3楼: Originally posted by 厚德求是 at 2018-08-11 22:16:59
PCR产物纯化后跑一下胶,看看是不是引物浓度高了,p出了非特异性条带。

这些都是正常的,我还是考虑星号活性的问题

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4楼2018-08-12 06:58:11
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芥末本绿

金虫 (正式写手)

引用回帖:
2楼: Originally posted by ttrying at 2018-08-11 20:18:33
检查基因内部是否有相应酶切位点,常用内切酶一般不会把基因切碎的。

检查过是没有的,设计引物得时候就看了

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5楼2018-08-12 06:58:58
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Tc148

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
缩短下酶切时间,1到2小时足够,没必要过夜

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6楼2018-08-17 20:43:08
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清华一只花

禁虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
本帖内容被屏蔽

7楼2018-08-18 01:20:19
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乐乐卡卡西

新虫 (初入文坛)


小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
你用的哪个公司的酶,我最多切3小时,效果OK的

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8楼2018-08-19 14:50:18
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