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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 分子生理 » 基因双酶切
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芥末本绿

金虫 (正式写手)

[交流] 基因双酶切 已有5人参与

PCR得到目的基因，胶回收后进行双酶切反应。30ul酶切体系。
1.胶回收后的浓度跑胶后应该有100ng/ul，双酶切的时候会不会浓度太高切不动？
2.EcoR 1酶切0.5h后就会产生星号活性，我们一般都是过夜切，双酶切以后基因出现多条带，有没有什么办法改进？

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1楼 2018-08-11 19:10:41
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ttrying

新虫 (小有名气)
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-12 08:58:30
检查基因内部是否有相应酶切位点，常用内切酶一般不会把基因切碎的。

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2楼2018-08-11 20:18:33
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厚德求是

金虫 (著名写手)

Ph. D. Prof.
★ ★
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-12 08:58:48
PCR产物纯化后跑一下胶，看看是不是引物浓度高了，p出了非特异性条带。

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3楼2018-08-11 22:16:59
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芥末本绿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
3楼: Originally posted by 厚德求是 at 2018-08-11 22:16:59
PCR产物纯化后跑一下胶，看看是不是引物浓度高了，p出了非特异性条带。

这些都是正常的，我还是考虑星号活性的问题

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4楼2018-08-12 06:58:11
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芥末本绿

金虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by ttrying at 2018-08-11 20:18:33
检查基因内部是否有相应酶切位点，常用内切酶一般不会把基因切碎的。

检查过是没有的，设计引物得时候就看了

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5楼2018-08-12 06:58:58
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Tc148

新虫 (初入文坛)
★
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缩短下酶切时间，1到2小时足够，没必要过夜

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6楼2018-08-17 20:43:08
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清华一只花

禁虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
本帖内容被屏蔽
7楼2018-08-18 01:20:19
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乐乐卡卡西

新虫 (初入文坛)
★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包，谢谢回帖
你用的哪个公司的酶，我最多切3小时，效果OK的

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8楼2018-08-19 14:50:18
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