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蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白测不到活性，求解答 已有2人参与

本人用镍柱纯化蛋白后，跑SDS发现咪唑浓度为20mM时条带最亮最宽，收集20mM咪唑的洗脱液之后，超滤浓缩（除咪唑了）之后发现测不到酶活。

细胞发酵液，细胞发酵液破碎后的液体，收集细胞重悬并破碎的液体，破碎液离心取的上清，以及经过镍柱第一次收集的液体均可以测到酶活且都较高.

0mM的咪唑也可以测到活性但相对较低，5.10.20...mM(除去咪唑和不除去均测不到)的洗脱液均测不到活性

未加IPTG诱导的工程菌测不到酶活

有大神可以为我解释一下吗？本人研二，这个问题解决不了怕真的要延期了 T.T
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1楼 2018-07-03 16:02:42
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yubeihong

铁杆木虫 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:25
20mM洗脱比较奇怪，一般这个浓度洗杂。100-300mM洗脱。我们用purimag的Ni磁珠是这样的。

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2楼2018-07-03 21:25:41
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蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yubeihong at 2018-07-03 21:25:41
20mM洗脱比较奇怪，一般这个浓度洗杂。100-300mM洗脱。我们用purimag的Ni磁珠是这样的。

先谢过了。。。

SDS显示经过5mM.10mM洗脱后杂蛋白已所剩无几了，20和50mM时条带都比较亮，200mM就只剩下很浅很细的一条带了，500mM完全就没有条带了
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3楼2018-07-04 10:03:37
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白话八股

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:46
5mM咪唑就能洗下来？你确定配置没问题？平衡液里面咪唑浓度都这个值了

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最爱的那个人会出现在身边。
4楼2018-07-04 10:22:55
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5就是5丫丫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
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西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:59
可能性有二个：
一是纯化的过程中你的蛋白失活了，所以导致有蛋白条带但无酶活；
二是你用20mM的咪唑洗脱得到的酶液里面可能没有你的目的蛋白，有可能是与之大小一致的杂蛋白，如果是这样的话，你的 目的蛋白并没有被洗脱下来；
   问下你纯化过程中滤出液有没有 酶活呢？另外你用100-300mM的咪唑洗脱之后的酶液是否有酶活呢？不能仅仅看蛋白多少来判定的，另外我看你都是通过SDS-PAGE检测 ，并没有做WB，建议你可以做个 WB看一下你的目标蛋白含量情况呢
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5楼2018-07-04 10:24:32
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蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 5就是5丫丫 at 2018-07-04 10:24:32
可能性有二个：
一是纯化的过程中你的蛋白失活了，所以导致有蛋白条带但无酶活；
二是你用20mM的咪唑洗脱得到的酶液里面可能没有你的目的蛋白，有可能是与之大小一致的杂蛋白，如果是这样的话，你的 目的蛋白并没 ...

纯化过程中滤出液有酶活。100-300mM还没有测活性，20,50mM测一下没有活性就没有信心了...，等测完后再给您答复  非常感谢！
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6楼2018-07-04 10:53:50
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蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 白话八股 at 2018-07-04 10:22:55
5mM咪唑就能洗下来？你确定配置没问题？平衡液里面咪唑浓度都这个值了

5/10mM确实可以把杂蛋白洗脱下来啊，伯乐的柱子，我觉得应该没问题啊，我们的平衡液不含咪唑的
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7楼2018-07-04 10:57:13
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nicky9266

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:22:14
1、蛋白失活；
2、20mM洗脱？我的裂解缓冲液里咪唑都20了……推测洗脱下来的不是目的蛋白，建议多个his的western确定下。
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8楼2018-07-06 15:53:27
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zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛐蛐儿儿 at 2018-07-04 10:57:13
5/10mM确实可以把杂蛋白洗脱下来啊，伯乐的柱子，我觉得应该没问题啊，我们的平衡液不含咪唑的...

楼主有解决这个问题吗？我遇到了一模一样的问题
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9楼2018-08-30 19:58:57
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