应《网络安全法》要求，自2017年10月1日起，未进行实名认证将不得使用互联网跟帖服务。为保障您的帐号能够正常使用，请尽快对帐号进行手机号验证，感谢您的理解与支持！

24小时热门版块排行榜    

小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 蛋白测不到活性，求解答
91/1返回列表
查看: 1742  |  回复: 8
只看楼主 @他人 存档 新回复提醒 (忽略) 收藏    在APP中查看

蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)

[求助] 蛋白测不到活性，求解答 已有2人参与

本人用镍柱纯化蛋白后，跑SDS发现咪唑浓度为20mM时条带最亮最宽，收集20mM咪唑的洗脱液之后，超滤浓缩（除咪唑了）之后发现测不到酶活。

细胞发酵液，细胞发酵液破碎后的液体，收集细胞重悬并破碎的液体，破碎液离心取的上清，以及经过镍柱第一次收集的液体均可以测到酶活且都较高.

0mM的咪唑也可以测到活性但相对较低，5.10.20...mM(除去咪唑和不除去均测不到)的洗脱液均测不到活性

未加IPTG诱导的工程菌测不到酶活

有大神可以为我解释一下吗？本人研二，这个问题解决不了怕真的要延期了 T.T
回复此楼

» 猜你喜欢
1楼 2018-07-03 16:02:42
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

yubeihong

铁杆木虫 (职业作家)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:25
20mM洗脱比较奇怪，一般这个浓度洗杂。100-300mM洗脱。我们用purimag的Ni磁珠是这样的。

发自小木虫IOS客户端
赞一下(1人) 回复此楼
2楼2018-07-03 21:25:41
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
2楼: Originally posted by yubeihong at 2018-07-03 21:25:41
20mM洗脱比较奇怪，一般这个浓度洗杂。100-300mM洗脱。我们用purimag的Ni磁珠是这样的。

先谢过了。。。

SDS显示经过5mM.10mM洗脱后杂蛋白已所剩无几了，20和50mM时条带都比较亮，200mM就只剩下很浅很细的一条带了，500mM完全就没有条带了
赞一下 回复此楼
3楼2018-07-04 10:03:37
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

白话八股

金虫 (正式写手)
★
西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:46
5mM咪唑就能洗下来？你确定配置没问题？平衡液里面咪唑浓度都这个值了

发自小木虫Android客户端
赞一下(1人) 回复此楼
最爱的那个人会出现在身边。
4楼2018-07-04 10:22:55
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

5就是5丫丫

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:59
可能性有二个：
一是纯化的过程中你的蛋白失活了，所以导致有蛋白条带但无酶活；
二是你用20mM的咪唑洗脱得到的酶液里面可能没有你的目的蛋白，有可能是与之大小一致的杂蛋白，如果是这样的话，你的 目的蛋白并没有被洗脱下来；
   问下你纯化过程中滤出液有没有 酶活呢？另外你用100-300mM的咪唑洗脱之后的酶液是否有酶活呢？不能仅仅看蛋白多少来判定的，另外我看你都是通过SDS-PAGE检测 ，并没有做WB，建议你可以做个 WB看一下你的目标蛋白含量情况呢
赞一下 回复此楼
5楼2018-07-04 10:24:32
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 5就是5丫丫 at 2018-07-04 10:24:32
可能性有二个：
一是纯化的过程中你的蛋白失活了，所以导致有蛋白条带但无酶活；
二是你用20mM的咪唑洗脱得到的酶液里面可能没有你的目的蛋白，有可能是与之大小一致的杂蛋白，如果是这样的话，你的 目的蛋白并没 ...

纯化过程中滤出液有酶活。100-300mM还没有测活性，20,50mM测一下没有活性就没有信心了...，等测完后再给您答复  非常感谢！
赞一下 回复此楼
6楼2018-07-04 10:53:50
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

蛐蛐儿儿

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
4楼: Originally posted by 白话八股 at 2018-07-04 10:22:55
5mM咪唑就能洗下来？你确定配置没问题？平衡液里面咪唑浓度都这个值了

5/10mM确实可以把杂蛋白洗脱下来啊，伯乐的柱子，我觉得应该没问题啊，我们的平衡液不含咪唑的
赞一下 回复此楼
7楼2018-07-04 10:57:13
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

nicky9266

新虫 (初入文坛)

【答案】应助回帖

★ ★
感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:22:14
1、蛋白失活；
2、20mM洗脱？我的裂解缓冲液里咪唑都20了……推测洗脱下来的不是目的蛋白，建议多个his的western确定下。
赞一下 回复此楼
8楼2018-07-06 15:53:27
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

zrj123456

新虫 (小有名气)
引用回帖:
7楼: Originally posted by 蛐蛐儿儿 at 2018-07-04 10:57:13
5/10mM确实可以把杂蛋白洗脱下来啊，伯乐的柱子，我觉得应该没问题啊，我们的平衡液不含咪唑的...

楼主有解决这个问题吗？我遇到了一模一样的问题
赞一下 回复此楼
9楼2018-08-30 19:58:57
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
相关版块跳转 我要订阅楼主 蛐蛐儿儿 的主题更新
91/1返回列表
普通表情 龙 兔 虎 猫
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[基金申请] 综述论文作为代表作会不会影响评审专家的印象分？ +11 yufeiwaner 2026-08-09 12/600 2026-08-12 01:27 by 南京中西医
[基金申请] 2019年青年基金涵评意见，大家看看几个A，几个B? +4 Tide man 2026-08-11 4/200 2026-08-12 00:39 by liuqidi
[基金申请] 有时候，自然基金真的不能太认真 （我的申报经验） +3 majunge000 2026-08-11 4/200 2026-08-11 20:13 by lch2012
[基金申请] 为什么网上很多人说本周 12号出结果 +6 瞬息宇宙 2026-08-10 7/350 2026-08-11 19:25 by Tide man
[论文投稿] 职称评审，求友友推荐见刊最快的期刊 +3 工厂打螺丝 2026-08-08 3/150 2026-08-11 13:42 by 会议编辑
[基金申请] FileCode能看出啥？ +7 要乐观耀哥 2026-08-10 17/850 2026-08-11 10:50 by 要乐观耀哥
[基金申请] 确定了，国自然21号放榜 +6 布布和一二 2026-08-10 7/350 2026-08-10 19:15 by 2000zf36392
[基金申请] 静等基金结果 +5 gjjjzhong 2026-08-10 16/800 2026-08-10 17:19 by Tide man
[基金申请] 关于Filecode分析方法 +3 majunge000 2026-08-10 3/150 2026-08-10 15:46 by lch2012
[基金申请] 据悉今年马上要出结果了 +7 瞬息宇宙 2026-08-10 8/400 2026-08-10 12:42 by Vivilian
[基金申请] 2026国自然放榜时间 +9 布布和一二 2026-08-08 9/450 2026-08-10 11:22 by xxxx2020
[基金申请] fileCode有新解读？ +10 Tide man 2026-08-08 18/900 2026-08-09 12:55 by 仁砚薪传
[基金申请] 国基金的申报应该改成非等额制，评价高的钱多评价低的钱少，但是增加资助率 +7 a089 2026-08-07 7/350 2026-08-08 18:05 by gltch
[基金申请] 关于filecode +4 布布和一二 2026-08-07 7/350 2026-08-07 22:55 by zhanghaozhu
[基金申请] 固定端突然变了，今天 +6 archvillain 2026-08-06 10/500 2026-08-07 16:03 by 医学老男孩
[基金申请] filecode变化情况 +6 布布和一二 2026-08-07 22/1100 2026-08-07 14:45 by 且听虎啸
[基金申请] 大家散了吧，后缀研究没有意义，别浪费时间了，过好目前的每一天，不要焦虑 +5 Tide man 2026-08-06 7/350 2026-08-07 13:11 by 医学老男孩
[基金申请] filecode +8 布布和一二 2026-08-06 11/550 2026-08-06 20:41 by tangpu318
[基金申请] 影响面上的因素 +8 布布和一二 2026-08-05 11/550 2026-08-06 10:41 by 宝贝虫子
[基金申请] 好消息？这个有何含义？？？ +8 Tide man 2026-08-05 10/500 2026-08-05 16:14 by xmuxiaoyu
信息提示
关闭
请填处理意见
关闭