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蛋白测不到活性，求解答 已有2人参与
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本人用镍柱纯化蛋白后，跑SDS发现咪唑浓度为20mM时条带最亮最宽，收集20mM咪唑的洗脱液之后，超滤浓缩（除咪唑了）之后发现测不到酶活。 细胞发酵液，细胞发酵液破碎后的液体，收集细胞重悬并破碎的液体，破碎液离心取的上清，以及经过镍柱第一次收集的液体均可以测到酶活且都较高. 0mM的咪唑也可以测到活性但相对较低，5.10.20...mM(除去咪唑和不除去均测不到)的洗脱液均测不到活性 未加IPTG诱导的工程菌测不到酶活 有大神可以为我解释一下吗？本人研二，这个问题解决不了怕真的要延期了 T.T |
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yubeihong
铁杆木虫 (职业作家)
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西门吹雪170: 金币+1, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:25
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20mM洗脱比较奇怪，一般这个浓度洗杂。100-300mM洗脱。我们用purimag的Ni磁珠是这样的。 发自小木虫IOS客户端 |
2楼2018-07-03 21:25:41
3楼2018-07-04 10:03:37
4楼2018-07-04 10:22:55
【答案】应助回帖
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感谢参与，应助指数 +1
西门吹雪170: 金币+3, 鼓励回帖交流 2018-08-31 08:21:59
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可能性有二个： 一是纯化的过程中你的蛋白失活了，所以导致有蛋白条带但无酶活； 二是你用20mM的咪唑洗脱得到的酶液里面可能没有你的目的蛋白，有可能是与之大小一致的杂蛋白，如果是这样的话，你的 目的蛋白并没有被洗脱下来； 问下你纯化过程中滤出液有没有 酶活呢？另外你用100-300mM的咪唑洗脱之后的酶液是否有酶活呢？不能仅仅看蛋白多少来判定的，另外我看你都是通过SDS-PAGE检测 ，并没有做WB，建议你可以做个 WB看一下你的目标蛋白含量情况呢 |
5楼2018-07-04 10:24:32
6楼2018-07-04 10:53:50
7楼2018-07-04 10:57:13
8楼2018-07-06 15:53:27
9楼2018-08-30 19:58:57