24小时热门版块排行榜    

查看: 1797  |  回复: 46

凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)


已领完
pGl3-SV40质粒重组,求教大神们
领取红包 (小木虫手机app专属红包)

扫一扫,下载小木虫客户端

小女子最近想在pGl3-SV40质粒上插入一段序列,图谱如下,拟插入目的片段位于SV40 promoter前面。目的片段经过Neb 0 cutter扫描后,可用酶切位点如下,AatII Acc65I AccI AclI AgeI AhdI AlwI AlwNI ApaLI ApoI AscI AsiSI AvrII BaeI BamHI BbsI BcgI BciVI BclI BglIBglIIBmgBIBmtI BsaAIBsaBI BsaHI BsaI BsaXI BsgI BsiEI BsiWI BsmBI BsmI BspDI BspHI BspQI BsrBI BsrDI BsrGI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII BstUI BstYI BstZ17I Bsu36I BtgZI ClaI CviQI DraI DraIII EagI EarI EcoNI EcoP15I EcoRI EcoRV Esp3I FseI FspI HgaI HincII HindIII HpaI Hpy166II HpyCH4IV KasI KpnI MboII MfeI MluCI MluI NaeI NarI NciI NgoMIV NheI NmeAIII NotI NruI NsiI PacI PflFI PflMI PluTI PmeI PmlI PsiI PvuI RsaI RsrII SacII SalI SapI SbfI ScaI SexAI SfaNI SfiI SfoI SgrAI SmaI SnaBI SpeI SphI SrfI SspI StuI SwaI TspMI Tth111I XbaI XmaI ZraI 。因此,我选了Acc65I和BmtI酶切位点进行双酶切,后准备用于连接。用于连接的片段两端加了21bp同源序列,进行连接后转化Dh5a 感受态细胞,长出的白色菌落比较少,且阴性对照也长出了许多菌落,是否表示酶切位点没有切开。
不知道这两个酶切位点是否可行,还请大神们指点,选择一个比较好的酶切位点来连接这段片段。
谢谢大家

pGl3-SV40质粒重组,求教大神们


发自小木虫Android客户端
回复此楼

» 猜你喜欢

» 抢金币啦!回帖就可以得到:

查看全部散金贴

已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)


其中两种酶都是用的NEb的,且在buffer 3.1中具有较高的活性,根据说明书酶切1h(说明书表明过度孵育会造成星号活性)。经琼脂糖鉴定,有片段,但是也不能确定是否酶切成功,因为切割位点之间只有几bp,经纯化后用于连接。
5楼2018-06-24 11:44:56
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)


大神们不要走啊,请大家赐教啊
11楼2018-06-24 11:58:03
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

du20131580

金虫 (正式写手)


★ ★ ★
小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
西门吹雪170: 金币+2, 鼓励回帖交流 2018-06-25 07:45:08
琼脂糖鉴定图片建议楼主po上来,不知道楼主跑电泳有没有加阳性对照呢,切开的线性化跟没切的质粒胶上看还是有点点差别,先确定是否切开的问题,然后再考虑要不要换酶切位点吧。另外这个连接体系不合适也可能才成转化不顺利,再有就是感受态细胞的问题,不知道同实验室的有没有一起做转化的,他们的结果怎么样呢。

发自小木虫Android客户端

» 本帖已获得的红花(最新10朵)

19楼2018-06-24 12:19:17
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)


送红花一朵
引用回帖:
19楼: Originally posted by du20131580 at 2018-06-24 12:19:17
琼脂糖鉴定图片建议楼主po上来,不知道楼主跑电泳有没有加阳性对照呢,切开的线性化跟没切的质粒胶上看还是有点点差别,先确定是否切开的问题,然后再考虑要不要换酶切位点吧。另外这个连接体系不合适也可能才成转化 ...

谢谢大神,这是当时酶切后的跑胶图,分别是15000 marker,没有切的阳性对照,和酶切1和酶切2.质粒条带大概在5000左右,从这个图应该看不出来是否切开吧
pGl3-SV40质粒重组,求教大神们-1



发自小木虫Android客户端
42楼2018-06-24 14:56:45
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

du20131580

金虫 (正式写手)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
引用回帖:
42楼: Originally posted by 凌儿凌夷 at 2018-06-24 14:56:45
谢谢大神,这是当时酶切后的跑胶图,分别是15000 marker,没有切的阳性对照,和酶切1和酶切2.质粒条带大概在5000左右,从这个图应该看不出来是否切开吧

...

大神不敢当啦,最近也是在做重组转化,遇到了类似的问题。这个图确实不太能看得出来,感觉质粒上样量是不是有点多呢,分不太开的话会不会是凝胶浓度不合适呢,1.2%的对于线性DNA长度400-7000算是比较合适哒。如果实在重复几次都没法成功连接转化的话,可以考虑换酶切位点。另外,感受态细胞也要考虑一下,我最近做的几次长板子点很少,完了换了新的感受态就顺利一些啦~以上仅个人拙见,希望楼主实验顺利~

发自小木虫Android客户端
45楼2018-06-24 17:35:58
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)


引用回帖:
45楼: Originally posted by du20131580 at 2018-06-24 17:35:58
大神不敢当啦,最近也是在做重组转化,遇到了类似的问题。这个图确实不太能看得出来,感觉质粒上样量是不是有点多呢,分不太开的话会不会是凝胶浓度不合适呢,1.2%的对于线性DNA长度400-7000算是比较合适哒。如果实 ...

谢谢只用了2微升,可能曝光时间长了点,有长出来菌,就是只有测序才知道有没有连上,可能还得考虑酶切位点问题也祝您实验顺利

发自小木虫Android客户端
46楼2018-06-24 23:40:07
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖

生物five啊

新虫 (初入文坛)



小木虫: 金币+0.5, 给个红包,谢谢回帖
您的同源臂的引物设计是正常设计的吗

发自小木虫Android客户端
47楼2023-10-26 18:47:33
已阅   回复此楼   关注TA 给TA发消息 送TA红花 TA的回帖
简单回复
2018-06-24 11:41   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2018-06-24 11:41   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 11:44   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
nono20096楼
2018-06-24 11:47   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 11:50   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
tzynew8楼
2018-06-24 11:51   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 11:52   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
KDME10楼
2018-06-24 11:57   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
MicroShop12楼
2018-06-24 11:58   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
C1041401613楼
2018-06-24 12:00   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2018-06-24 12:03   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
wukangming15楼
2018-06-24 12:03   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 12:05   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
zongcwei17楼
2018-06-24 12:05   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
du2013158018楼
2018-06-24 12:10   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 12:29   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 12:31   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
aishida22楼
2018-06-24 12:33   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 12:45   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
wxiaona24楼
2018-06-24 12:48   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
大虫199225楼
2018-06-24 12:50   回复  
wasxnbe26楼
2018-06-24 12:52   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2018-06-24 12:55   回复  
2018-06-24 13:00   回复  
BiotageAB29楼
2018-06-24 13:05   回复  
2018-06-24 13:05   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
yexuqing31楼
2018-06-24 13:09   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
三八洲32楼
2018-06-24 13:09   回复  
petty0433楼
2018-06-24 13:13   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
343534楼
2018-06-24 13:14   回复  
YanZsy35楼
2018-06-24 13:16   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
cjinfor36楼
2018-06-24 13:17   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
2018-06-24 13:19   回复  
2018-06-24 13:21   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
diadia_8839楼
2018-06-24 13:27   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2018-06-24 13:31   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫Android客户端
Yeven_Wong41楼
2018-06-24 13:36   回复  
凌儿凌夷(金币+1): 谢谢参与
已获得1个金币 发自小木虫IOS客户端
2018-06-24 17:18   回复  
小木鸭44楼
2018-06-24 17:18   回复  
相关版块跳转 我要订阅楼主 凌儿凌夷 的主题更新
最具人气热帖推荐 [查看全部] 作者 回/看 最后发表
[教师之家] 优秀毕业论文 指导教师,普通老师有希望吗? +4 河西夜郎 2024-05-17 5/250 2024-05-18 22:41 by lide966
[硕博家园] 又忍不住想吐槽文科的学术圈 +3 nvizqxuf 2024-05-18 4/200 2024-05-18 22:12 by qwwertf
[考博] 考博跨专业可以跨多远 +4 竹外。。。 2024-05-18 5/250 2024-05-18 21:58 by wrgeng
[考博] 有博导缺学生吗,我可以当牛做马 +34 刘秋彤 2024-05-13 58/2900 2024-05-18 18:30 by 铁首星空
[基金申请] 国自然青基把共同第一作者标成了唯一第一作者 +27 1137025804 2024-05-15 29/1450 2024-05-18 16:22 by CQmadfrog
[基金申请] 申请基金代表性成果 +11 lancet0903 2024-05-17 11/550 2024-05-18 13:37 by pinyuan33
[考博] 换导师 +5 是柠檬呀! 2024-05-18 10/500 2024-05-18 11:16 by 是柠檬呀!
[有机交流] 求助在硝基苯上进行F-C反应甲基化的方案 105+3 epj006144 2024-05-14 8/400 2024-05-18 10:17 by zyp0009928
[基金申请] 这个模块怎么成了烧香拜佛的地方了 +5 shrz98 2024-05-18 5/250 2024-05-18 09:50 by 鱼翔浅底1
[考博] 双非院士组还是211普通老师 +9 timergoi 2024-05-14 10/500 2024-05-18 08:31 by 3001160025
[论文投稿] 当前scientific reports还值得投稿么? +5 lizhengke06 2024-05-14 6/300 2024-05-17 18:28 by dxcharlary
[基金申请] 面上评委可能变为7个了,是好是坏呢? +20 suiyuanwgz 2024-05-15 25/1250 2024-05-17 17:05 by 能丫
[硕博家园] 海外博士,国内博后找工作求建议 +7 905452934 2024-05-16 17/850 2024-05-17 12:41 by 905452934
[论文投稿] 手稿提交了两遍 10+3 氧化还原剂 2024-05-14 4/200 2024-05-16 22:43 by nono2009
[基金申请] 12个本子最多让给1a2b +16 地球e村长 2024-05-13 19/950 2024-05-16 17:48 by sars518
[硕博家园] 导师这样说到底有没有机会啊……… +7 理科生yes 2024-05-14 14/700 2024-05-15 18:45 by 理科生yes
[职场人生] 硕士毕业四年工作不顺心 +4 noora2018 2024-05-14 4/200 2024-05-15 15:19 by 1158057902
[基金申请] 2024工材口的国自然开始涵评了吗? +3 Thanks1989 2024-05-13 3/150 2024-05-14 22:27 by weiyongscut
[考博] 韩国成均馆大学 软物质杂化材料研究室 Koo Chong Min 教授课题组 诚招博士生 +5 NWPUGZG 2024-05-13 9/450 2024-05-13 16:40 by NWPUGZG
[考博] 24/25申博,科研助理找导师 +9 cc毕业了吗 2024-05-12 9/450 2024-05-13 14:31 by zxl_1105
信息提示
请填处理意见