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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » DNA重组 » pGl3-SV40质粒重组，求教大神们
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凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)
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pGl3-SV40质粒重组，求教大神们
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小女子最近想在pGl3-SV40质粒上插入一段序列，图谱如下，拟插入目的片段位于SV40 promoter前面。目的片段经过Neb 0 cutter扫描后，可用酶切位点如下，AatII Acc65I AccI AclI AgeI AhdI AlwI AlwNI ApaLI ApoI AscI AsiSI AvrII BaeI BamHI BbsI BcgI BciVI BclI BglIBglIIBmgBIBmtI BsaAIBsaBI BsaHI BsaI BsaXI BsgI BsiEI BsiWI BsmBI BsmI BspDI BspHI BspQI BsrBI BsrDI BsrGI BssHII BssSI BstAPI BstBI BstEII BstUI BstYI BstZ17I Bsu36I BtgZI ClaI CviQI DraI DraIII EagI EarI EcoNI EcoP15I EcoRI EcoRV Esp3I FseI FspI HgaI HincII HindIII HpaI Hpy166II HpyCH4IV KasI KpnI MboII MfeI MluCI MluI NaeI NarI NciI NgoMIV NheI NmeAIII NotI NruI NsiI PacI PflFI PflMI PluTI PmeI PmlI PsiI PvuI RsaI RsrII SacII SalI SapI SbfI ScaI SexAI SfaNI SfiI SfoI SgrAI SmaI SnaBI SpeI SphI SrfI SspI StuI SwaI TspMI Tth111I XbaI XmaI ZraI 。因此，我选了Acc65I和BmtI酶切位点进行双酶切，后准备用于连接。用于连接的片段两端加了21bp同源序列，进行连接后转化Dh5a 感受态细胞，长出的白色菌落比较少，且阴性对照也长出了许多菌落，是否表示酶切位点没有切开。
不知道这两个酶切位点是否可行，还请大神们指点，选择一个比较好的酶切位点来连接这段片段。
谢谢大家

pGl3-SV40质粒重组，求教大神们


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1楼2018-06-24 11:40:25
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du20131580

金虫 (正式写手)
★
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引用回帖:
42楼: Originally posted by 凌儿凌夷 at 2018-06-24 14:56:45
谢谢大神，这是当时酶切后的跑胶图，分别是15000 marker，没有切的阳性对照，和酶切1和酶切2.质粒条带大概在5000左右，从这个图应该看不出来是否切开吧

...

大神不敢当啦，最近也是在做重组转化，遇到了类似的问题。这个图确实不太能看得出来，感觉质粒上样量是不是有点多呢，分不太开的话会不会是凝胶浓度不合适呢，1.2%的对于线性DNA长度400-7000算是比较合适哒。如果实在重复几次都没法成功连接转化的话，可以考虑换酶切位点。另外，感受态细胞也要考虑一下，我最近做的几次长板子点很少，完了换了新的感受态就顺利一些啦～以上仅个人拙见，希望楼主实验顺利～

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45楼2018-06-24 17:35:58
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凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)
其中两种酶都是用的NEb的，且在buffer 3.1中具有较高的活性，根据说明书酶切1h（说明书表明过度孵育会造成星号活性）。经琼脂糖鉴定，有片段，但是也不能确定是否酶切成功，因为切割位点之间只有几bp，经纯化后用于连接。
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5楼2018-06-24 11:44:56
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凌儿凌夷

铜虫 (小有名气)
大神们不要走啊，请大家赐教啊
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11楼2018-06-24 11:58:03
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hdchina20102楼
2018-06-24 11:41   回复  
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巫山沧海3楼
2018-06-24 11:41   回复  
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Vet is king4楼
2018-06-24 11:44   回复  
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nono20096楼
2018-06-24 11:47   回复  
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烟台硅胶板7楼
2018-06-24 11:50   回复  
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tzynew8楼
2018-06-24 11:51   回复  
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sky蒲公英9楼
2018-06-24 11:52   回复  
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KDME10楼
2018-06-24 11:57   回复  
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MicroShop12楼
2018-06-24 11:58   回复  
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C1041401613楼
2018-06-24 12:00   回复  
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润色论文14楼
2018-06-24 12:03   回复  
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