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103007054025铜虫 (小有名气)
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[求助]
一个表达载体里插入两个蛋白在大肠杆菌中实现同时表达 已有3人参与
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大家好，我有一个问题想咨询一下大家，现在有两个蛋白MW分别是36KD和40KD,而且这两个蛋白在酶促反应中是共同起作用的， 因此我想做一个共同表达，即在一个表达载体里插入两个蛋白，分别表达这2个蛋白，想把这两个蛋白构建在同一个读码框内，那么在构建载体的时候，有几个问题想咨询一下大家： （1）是否可以共用同一个启动子？共用同一个启动子的话表达效率怎么样，有没有做过的呀？ （2）目的基因1的终止密码子是否需要去除？ （3）目的基因1与目的基因2之间是否需要加上一个柔性Linker？ （4）构建的结构是这样：启动子--操纵子--RBS--目的基因1---柔性Linker--目的基因2---终止密码子---terminator还是 启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---柔性Linker--目的基因2---终止密码子---terminator |
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【答案】应助回帖
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可以插入两个蛋白基因在一个载体上面表达，我干过，相当不错。 你这各个元件的分布有问题，可以这样: ........RBS-目的基因1-终止子-RBS-目的基因2-终止密码子-terminator 中间不一定需要linker |
1030070540254楼2018-06-06 20:27:00
用户晓晓
木虫 (正式写手)
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【答案】应助回帖
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1，原核生物中,一个启动子可以同时启动多个基因。在真核生物中,一般一个启动子只能启动一个基因（一般一般一般）。 2，目的基因1的终止子问题，有这个终止子那么就是两个基因，去掉这个终止子，如果阅读框不移码，那两个基因此时可以认为是一个基因（也就是你想说的融合蛋白）。此时一个启动子就足够了。所以如果用一个启动子 那么基因1的终止子必须去除。 3，linker需要！（这个要不要主要跟你的蛋白有关，融合蛋白要发挥功能要保证不能大范围破坏原始蛋白的三级结构，比如你要融合的是简单的标签蛋白那么久没有必要加linker.。但是你要融合的是两个复杂的功能蛋白，最好加linker）。 4，中间有终止子后面的还怎么继续翻译？so...... 祝楼主实验顺利！ |
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2楼2018-06-06 17:21:24
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soarrow
铁杆木虫 (正式写手)
酱油歪楼党
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【答案】应助回帖
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可以用双启动子表达载体，比如Novagen的 pACYCDuet系列，两个T7 启动子。 也可以用一个启动子进行串联表达或者融合表达。4楼已经说了具体内容。 但是融合表达对两个酶的活性有没有影响？这个不能确定。如果要靠谱的话，建议把融合表达作为平行实验，这样即使表达后万一没有活性也不那么影响进度。  |
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5楼2018-06-07 03:54:51
