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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 分子生物 » 综合其他 » 一个表达载体里插入两个蛋白在大肠杆菌中实现同时表达
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103007054025

铜虫 (小有名气)

[求助] 一个表达载体里插入两个蛋白在大肠杆菌中实现同时表达 已有3人参与

大家好，我有一个问题想咨询一下大家，现在有两个蛋白MW分别是36KD和40KD,而且这两个蛋白在酶促反应中是共同起作用的，
因此我想做一个共同表达，即在一个表达载体里插入两个蛋白，分别表达这2个蛋白，想把这两个蛋白构建在同一个读码框内，那么在构建载体的时候，有几个问题想咨询一下大家：
（1）是否可以共用同一个启动子？共用同一个启动子的话表达效率怎么样，有没有做过的呀？
（2）目的基因1的终止密码子是否需要去除？
（3）目的基因1与目的基因2之间是否需要加上一个柔性Linker？
（4）构建的结构是这样：启动子--操纵子--RBS--目的基因1---柔性Linker--目的基因2---终止密码子---terminator还是
启动子--操纵子--RBS--目的基因1---终止密码子---柔性Linker--目的基因2---终止密码子---terminator
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1楼 2018-06-06 16:57:49
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回帖支持 ( 显示支持度最高的前 50 名 )

用户晓晓

木虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★ ★ ★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+3, 鼓励交流 2018-07-17 09:02:49
1，原核生物中,一个启动子可以同时启动多个基因。在真核生物中,一般一个启动子只能启动一个基因（一般一般一般）。
2，目的基因1的终止子问题，有这个终止子那么就是两个基因，去掉这个终止子，如果阅读框不移码，那两个基因此时可以认为是一个基因（也就是你想说的融合蛋白）。此时一个启动子就足够了。所以如果用一个启动子 那么基因1的终止子必须去除。
3，linker需要！（这个要不要主要跟你的蛋白有关，融合蛋白要发挥功能要保证不能大范围破坏原始蛋白的三级结构，比如你要融合的是简单的标签蛋白那么久没有必要加linker.。但是你要融合的是两个复杂的功能蛋白，最好加linker）。
4，中间有终止子后面的还怎么继续翻译？so......

祝楼主实验顺利！
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103007054025
2楼2018-06-06 17:21:24
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
用双启动子载体不可以吗

发自小木虫Android客户端
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3楼2018-06-06 17:55:12
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soarrow

铁杆木虫 (正式写手)

酱油歪楼党

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-07-17 09:03:17
可以用双启动子表达载体，比如Novagen的 pACYCDuet系列，两个T7 启动子。
也可以用一个启动子进行串联表达或者融合表达。4楼已经说了具体内容。
但是融合表达对两个酶的活性有没有影响？这个不能确定。如果要靠谱的话，建议把融合表达作为平行实验，这样即使表达后万一没有活性也不那么影响进度。
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103007054025
5楼2018-06-07 03:54:51
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普通回帖

863828916

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

★
感谢参与，应助指数 +1
drwhoknowss: 金币+1, 鼓励交流 2018-07-17 09:02:59
可以插入两个蛋白基因在一个载体上面表达，我干过，相当不错。
你这各个元件的分布有问题，可以这样: ........RBS-目的基因1-终止子-RBS-目的基因2-终止密码子-terminator
中间不一定需要linker
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103007054025
4楼2018-06-06 20:27:00
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103007054025

铜虫 (小有名气)
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引用回帖:
4楼: Originally posted by 863828916 at 2018-06-06 20:27:00
可以插入两个蛋白基因在一个载体上面表达，我干过，相当不错。
你这各个元件的分布有问题，可以这样: ........RBS-目的基因1-终止子-RBS-目的基因2-终止密码子-terminator
中间不一定需要linker

嗯嗯，我的元件分布确实存在问题 ，非常感谢你的解答，谢谢啦
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6楼2018-06-09 18:32:00
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103007054025

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
2楼: Originally posted by 用户晓晓 at 2018-06-06 17:21:24
1，原核生物中,一个启动子可以同时启动多个基因。在真核生物中,一般一个启动子只能启动一个基因（一般一般一般）。
2，目的基因1的终止子问题，有这个终止子那么就是两个基因，去掉这个终止子，如果阅读框不移码， ...

非常感谢您的答复，谢谢您
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7楼2018-06-09 18:32:54
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103007054025

铜虫 (小有名气)
引用回帖:
3楼: Originally posted by biosci at 2018-06-06 17:55:12
用双启动子载体不可以吗

可以的，谢谢
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8楼2018-06-09 18:33:11
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103007054025

铜虫 (小有名气)
送红花一朵
引用回帖:
5楼: Originally posted by soarrow at 2018-06-07 03:54:51
可以用双启动子表达载体，比如Novagen的 pACYCDuet系列，两个T7 启动子。
也可以用一个启动子进行串联表达或者融合表达。4楼已经说了具体内容。
但是融合表达对两个酶的活性有没有影响？这个不能确定。如果要靠谱 ...

嗯嗯，感谢您的答复，谢谢您
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9楼2018-06-09 18:34:17
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1490249816

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
5楼: Originally posted by soarrow at 2018-06-07 03:54:51
可以用双启动子表达载体，比如Novagen的 pACYCDuet系列，两个T7 启动子。
也可以用一个启动子进行串联表达或者融合表达。4楼已经说了具体内容。
但是融合表达对两个酶的活性有没有影响？这个不能确定。如果要靠谱 ...

共表达载体pETDuet-1可以同时做2个基因？
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10楼2018-07-16 10:20:36
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