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小木虫论坛-学术科研互动平台 » 生物医药区 » 生物科学 » 蛋白/酶 » 就问大神们，原核表达在上清里，然后要咋验证生物活性呀
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草哥cium

新虫 (正式写手)

[求助] 就问大神们，原核表达在上清里，然后要咋验证生物活性呀 已有2人参与

大神们我有一个问题，我总感觉自己氨基酸序列有突变，因为当初用的tap酶扩增的549bp片段用来做表达，不过也表达出来了，还在上清。所以想问问大神们，是不是一般要是氨基酸序列不太对是不会表达或者表达在上清的哇，一般都是咋验证蛋白质是不是有生物活性呀。。

@hc-material 发自小木虫Android客户端
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1楼 2018-05-30 20:23:43
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草哥cium

新虫 (正式写手)
送红花一朵
引用回帖:
4楼: Originally posted by 863828916 at 2018-05-30 21:38:33
蛋白序列也不知道吗？实验室没有高保真酶？
氨基酸突变的话有可能会导致蛋白不再上清，也有可能导致蛋白失活，但是这个不是绝对的。好多氨基酸突变了蛋白仍然表达，仍然有活性。so你直接把表达的蛋白用亲和柱提取 ...

大神，是不是基本上 上清表达了就是蛋白质正确折叠了，就是有活性的哇。。。只是要是氨基酸突变了，可能活性改变了?  本人菜鸟

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5楼2018-05-30 21:52:33
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普通回帖

863828916

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
突没突变直接测个序不就知道了啊？
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2楼2018-05-30 20:53:20
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草哥cium

新虫 (正式写手)
引用回帖:
2楼: Originally posted by 863828916 at 2018-05-30 20:53:20
突没突变直接测个序不就知道了啊？

ncbi..上没我这个序列。。第一个做的 没办法比对哇

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3楼2018-05-30 21:29:24
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863828916

金虫 (正式写手)

【答案】应助回帖

引用回帖:
3楼: Originally posted by 草哥cium at 2018-05-30 21:29:24
ncbi..上没我这个序列。。第一个做的 没办法比对哇
...

蛋白序列也不知道吗？实验室没有高保真酶？
氨基酸突变的话有可能会导致蛋白不再上清，也有可能导致蛋白失活，但是这个不是绝对的。好多氨基酸突变了蛋白仍然表达，仍然有活性。so你直接把表达的蛋白用亲和柱提取出来直接测活性吧，毕竟活性好的话还管他图没突变
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草哥cium
4楼2018-05-30 21:38:33
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biosci

捐助贵宾 (职业作家)
不可能ncbi都比对不出来

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6楼2018-05-30 21:59:19
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草哥cium

新虫 (正式写手)
引用回帖:
6楼: Originally posted by biosci at 2018-05-30 21:59:19
不可能ncbi都比对不出来

因为没人做个这个蛋白啊...这个相近种的cdna 都是不久才被race法扩出来，类似文章才三篇。我研究的这个种的这个蛋白根本没人做过

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7楼2018-05-30 22:12:43
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863828916

金虫 (正式写手)
引用回帖:
5楼: Originally posted by 草哥cium at 2018-05-30 21:52:33
大神，是不是基本上 上清表达了就是蛋白质正确折叠了，就是有活性的哇。。。只是要是氨基酸突变了，可能活性改变了?  本人菜鸟
...

在上清说明蛋白折叠可以，但是突变的话不一定会导致蛋白不正确折叠。氨基酸突变也不一定会导致活性丧尸，若突变发生在活性中心就可能会导致失活。所以你直接把蛋白提取出来直接先测活咯

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8楼2018-05-30 22:26:05
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hc-material

专家顾问 (职业作家)

【答案】应助回帖

感谢参与，应助指数 +1
做Western Blot验证活性
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9楼2018-05-31 08:32:23
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Jack1508

新虫 (初入文坛)
引用回帖:
9楼: Originally posted by hc-material at 2018-05-31 08:32:23
做Western Blot验证活性

wn能验证活性么？我一直认为wb是用来定性的。理论上不是wb过程中蛋白不是已经变性了么
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10楼2018-05-31 14:32:30
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